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at的原理(at 原理)at变速箱P档原理：当换档操纵手柄位置置于该位置时，停车锁止机构将变速器输出轴锁止。P档时传动轴被在变速箱内被部分锁死，所以此时平地上不踩刹车，车辆也有一定制动力。
P档是一个通过将变速器输出轴部分进行机械锁止来达到固定车辆目的特殊空档，其功能就是停车后的刹车，防止车辆发生移动。
P档的核心功能是实现at变速箱持久安全的坡道停车，这也是整个自动挡轿车界里P档的关键作用所在。当车辆停在平地时，无论是自动挡还是手动挡的轿车都只需使用手刹就能长时间将汽车稳固在路面上。如果在坡道上停车，手刹的制动负担就非常大，与刹车有关的弹簧和钢丝会随时间而变形，若彻底失去制动力将导致溜车。
扩展资料：
自动挡的发展：
世界上第一台用于大规模生产的的at变速箱是通用汽车公司在1940年代生产的Hydra-Matic，这台变速器使用液力耦合器（而不是液力变矩器）和三排行星齿轮提供四个前进挡和一个倒挡。Hydra-Matic最初被装于奥兹莫比尔汽车，而后凯迪拉克和庞蒂克也采用这种变速器。
自动变速器最重要的改进是在二战期间，别克汽车为坦克开发出液力变矩器，有助于避免坦克在战场上因换挡不慎而造成引擎熄火，到1948年，这种液力变矩器与其它部件结合成为液力变速器而定型成为现在通用的自动变速器。1968年法国雷诺汽车公司率先在自动变速器上使用电子元件。
1970年代，美国每年生产的600万～800万辆轿车中，at变速箱的装备率已超过90%。2015年本田汽车率先发表十前速自排，2016年福特和雪佛兰车厂也先后推出十前速自排，挡位愈多每个挡位之间的齿轮比落差愈小，可减少换挡震动和减缓升挡时扭力衰退的时间，或在最后几个挡位使用更省油的齿轮比。
靠液力变矩器产生液压动力。
AT变速箱的工作原理，实际上就是在一个充满液压油的空间里面装配两个涡轮叶片，分别和动力输入端、输出端相连接，是通过流体力学的原理在两个叶片之间进行动力转换，也就是通过动力输入端的叶轮产生强大的涡流来推动输出端的叶轮，从而实现动力传递，而正是这种方式降低了传动效率，增加了油耗，而且是越极端的加油门，传动效率越低下。
1.轻型龙门加工中心机床概述
轻型定梁龙门机床为工作台移动、横梁固定式龙门机床，可带刀库，也可不带刀库。机床由床身、立柱和固定横梁构成高刚度封闭框架。工作台在床身导轨上做纵向运动，该向为X坐标;溜板在横梁导轨上做横向运动，该向为Y坐标;滑枕镗铣头在溜板导轨上做垂向运动，该向为Z坐标。机床采用SIEMENS840DE控制系统，机床的X、Y、Z三轴都是CNC控制轴，主轴采用西门子公司交流主轴电动机驱动，X、Y、Z三向进给采用西门子公司伺服电动机驱动。可以实现三维直线插补、二维圆弧插补和任意三轴联动。
2.自动换刀控制要求
2.1刀库控制
刀库可以为盘式刀库，刀库容量为20位，主轴与刀库换刀采用无机械手，就近找刀，原位直接换刀的方式;也可以用链式刀库，刀库容量为40把刀，采用机械手，任意找刀，任意换刀方式。刀库盘由电动机通过齿轮降速驱动，有正、反转和停止控制。为使刀库盘快速停止，在电动机输出轴上加有一失电摩擦制动器。当停止信号发出时，即令该制动器的电磁铁失电，从而使刀库停止转动。刀库盘转动的分度和定位由马氏机构、零位开关和计数开关实现。刀库每转到一个刀位，计数开关即动作一次。当刀库转到零位时，零位开关也动作。当刀库转到指定刀位时，计数开关或零位开关动作，这时立即使电动机停转，制动器失电制动，从而刀库盘停止并依靠马氏机构精确定位在换刀位置。刀库停止后，计数开关或零位开关断开，这时应提示报警。
2.2气动控制
刀库防护门开关和主轴锥孔吹气由气动控制，气源气体经处理后供给汽缸。刀库防护门开关由一气缸来驱动，控制由二位四通双电控换向阀来完成。该换向阀的特点是：换向阀的两个位置，分别由两个电磁铁控制，而且换向阀时只需要给电磁铁一个短暂的电信号（电信号待续时间为2s）即可完成换向。只有给另一个电磁铁一个短暂电信号后，换向阀才会换到另一个位置。主轴锥孔吹气用来清洁主轴锥孔，吹气接通用一个二位三通电控截止阀来实现。当松刀开始时，给该电磁铁通电，开始锥孔吹气，直至松刀状态结束时，电磁铁失电，吹气停止。
2.3主轴拉刀控制
主轴内部装有刀具自动拉紧机构，该机构由碟簧拉紧、液压松开刀具。刀具的拉紧和松开由一个两位四通电磁阀控制。拉刀机构分为有刀、无刀、松刀，由三个无触头感应开关监测这三个状态。
刀具的拉紧及松开可以由指令控制，也可以由操作面板上的按钮控制。刀具的松开和拉紧状态应在面板上有所显示。主轴的转动和刀具的拉紧和松开动作为互锁关系。
3.马氏机构
刀库动作过程本加工中心的刀库由马氏机构刀库盘、零位开关、计数开关、刀库门开关阀和行程开关、主轴吹气阀等组成。马氏机构刀库自动换刀是主轴移动到刀库，利用主轴的松拉刀动作直接在刀库盘上抓刀、还刀。在接近刀库盘和离开刀库盘时都需要慢速移动，以免与刀库盘或者刀具发生碰撞造成事故，在其他位置就需要用快速移动来节约时间。刀库的运动包括三个过程即主轴抓刀，主轴还刀和主轴换刀。主轴将运动到的几个点，S1～S14表示滑枕和溜板运动的过程。主轴抓刀、主轴还刀和主轴换刀三个过程都可以用图解分析出来。
3.1主轴抓刀过程
主轴抓刀是要求现在无刀的主轴去抓刀库盘上的刀。动作是Y轴横向移动到达刀库顶端，Z轴向下移动到达刀具刀位并抓刀后，Y轴横向移动离开刀库（括弧号里内容是对Y和Z轴动作的描述）：S1（Z轴到P0，快速）→S2（Y轴到P1，快速）→主轴定向，第一软限位生效，刀库门开→S8（Y轴到P2，快速）→主轴松刀→S7（Z轴到P3，快速）→S6（Z轴到P4，慢速）→主轴紧刀→S12（Y轴到P5，慢速）→S13（Y轴到P6，快速）→S14（Z轴到P1，快速）→第二软限位生效，主轴定向取消，刀库门关。
3.2主轴还刀过程
主轴还刀是把主轴上的刀还回刀库盘上原刀位。动作是Y轴横向移动到达刀具刀位并松刀后，Z向上离开刀具到刀库顶端，Y轴横向离开刀库：S1（Z轴到P0，快速）→S2（Y轴到P1，快速）→主轴定向，第一软限位生效→S3（Z轴到P6，快速）→刀库门开→S4（Y轴到P5，快速）→S5（Y轴到P4，慢速）→主轴松刀→S11（Z轴到P3，慢速）→S10（Z轴到P2，快速）→S9（Y轴到P1，快速）→第二软限位生效，主轴定向取消，主轴紧刀，刀库门关。
3.3主轴换刀过程
主轴换刀是要求把主轴上的刀还回刀库盘上原刀位，并且再抓另外一把刀库盘上的刀。动作是Y轴横向移动到达刀具刀位并松刀后，Z向上离开刀具到刀库顶端，刀库盘转动找刀，Z轴向下移动到达刀具刀位并抓刀后，Y轴横向移动离开刀库：S1（Z轴到P0，快速）→S2（Y轴到P1，快速）→主轴定向，第一软限位生效→S3（Z轴到P6，快速）→刀库门开→S4（Y轴到P5，快速）→S5（Y轴到P4，慢速）→主轴松刀→S11（Z轴到P3，慢速）→S10（Z轴到P2，快速）→刀库盘旋转，刀库找刀→S7（Z轴到P3，快速）→S6（Z轴到P4，慢速）→主轴紧刀→S12（Y轴到P5，慢速）→S13（Y轴到P6，快速）→S14（Z轴到P1，快速）→第二软限位生效，主轴定向取消，刀库门关。
二、马氏机构刀库自动控制程序说明
根据自动换刀控制要求和动作过程编制PLC进行调试，使ATC正常工作。
1.加工中心I/O点安排
1.1输入点安排I33.2：主轴紧刀到位开关（上位），I33.3：主轴紧刀到位开关（中位），I33.4：主轴松刀到位开关（下位），I36.3：主轴松刀按钮开关按下，I36.4：主轴紧刀按钮开关按下，I62.0：刀库ATC生效，I62.1：刀库ATC失效，I62.2：刀库点动，I62.3：刀库回零，I62.4：刀库盘正转，I62.5：刀库盘反转，I62.7：刀库计数，I63.0：刀库零位，I63.1：刀库门开，I63.2：刀库门关，I63.3：刀库电动机监控，I63.4：刀库锁。
1.2输出点安排Q49.0：主轴松刀阀，Q49.3：主轴松刀，Q56.0：刀库ATC生效灯，Q56.1：刀库点动，Q56.2：刀库电动机正转，Q56.3：刀库电动机反转，Q56.4：刀库制动器，Q56.5：刀库门开阀，Q56.6：刀库门闭阀，Q56.7：主轴吹气阀。
2.程序功能块安排说明
FC51：主轴松拉刀，FC66：马氏机构刀库T码处理，FC67：马氏机构刀库M码处理，FC68：马氏机构刀库综合处理。
3.PLC程序调试说明
刀库调试时需要对各个电气元器件进行单步调试，保证每一件电气元器件都能正常工作;然后根据刀库的抓刀，换刀，还刀等动作进行全部动作的手动强制执行，检验程序的执行情况;最后才能使用T和M指令在自动方式下进行程序的连续自动执行，使刀库能正常运行。
三、结束语
我们的ATC通过在企业的多个产品上实际运行测试，运行情况良好，达到了控制要求。由于ATC原理及经验大同小异，对不同类型数控系统机床也有一定的参考作用。
at变速箱不是手自一体，at是指液力机械变速箱，它由液力变矩器、液压自动换挡控制系统、行星齿轮变速器、电控系统、冷却和滤油装置和油泵组成。手自一体是指具有手动换挡的某种自动变速器，它是指变速箱的一种结构形式。
at变速箱工作原理
at变速箱是通过液力传递和齿轮的组合方式来达到变速的目的，其中液力变矩器是at变速箱的精髓所在。在运转时，液力变矩器的作用就是将发动机的动力传递到变速系统，当变矩器的泵轮转动时，会带动其腔内的油液，油液转动会带动涡轮旋转，这个过程会将发动机的动力传递出去。
由于液力变矩器的自动变速变矩范围不够大，因此串联在涡轮后面的行星齿轮就会提高其变速变矩的效率，从而达到自动变速变矩的目的。
au怎么标记(au怎么标记出入点)足金是含金量等于或大于99%的黄金，俗称二九金，打的标志是足金，或99金或G99等。含金量千分数不小于999地称为千足金，是首饰成色命名中最高值。标志为千足金、999金、gold999或g999。
千足金肯定是足金，但足金则不一定是千足金，含金量还有更高些的，即含金量为99.99%，俗称四九金，一般用四九金来制作黄金首饰是很少的，国库里的金砖都是四九金。
购买黄金首饰，首先要认清黄金首饰的质量检验标识。市场上销售的黄金首饰，多数配有质检机构的检验标识，标识明确标注首饰的金含量、重量。999金又称千足金，金含量不低于999‰；990金称足金，金含量不低于990‰；22K金的金含量不低于916‰；18K金的金含量不低于750‰；14K金的金含量不低于585‰；9K金的金含量不低于375‰。
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黄金首饰上用G来标示,Gold英文是黄金,金条是用AU标示,K金用K标示,镀金用GP标示,包金用GF标示。黄金是一种软的,金黄色的,抗腐蚀的贵金属。
用AU调整音乐声音大小（以AU3.0为例）：
1：运行AU3.0并在单轨窗口打开待处理的音频文件；
2：点：效果--振幅和压限--标准化；
3：在弹出的标准化对话框的标准到后面的框里，输入你希望音量大小的数字，试听满意后点确定按钮；
4：保存文件。
你也可以试试用效果--振幅和压限--包络或在多轨里用音量包络线来调整。
购买黄金时要注意查看黄金首饰的标签印记。根据贵金属的相关标注规定，首饰印记内容应包括厂家代号、纯度、材料及镶钻首饰主钻石（0.10克拉以上）的质量等信息，如纯黄金的含量应不低于99%，其在饰品上的印记应为足金；K金的印记应为“XXK”。要注意检查黄金首饰的硬度。含铜越多的黄金质地越硬。要注意观察黄金首饰外观颜色。仿冒品多为铜合金制作而成，其颜色较浅。此外，还要认清所购黄金首饰是纯黄金还是镀金、包金首饰。
同时，购买时索要正规发票、商品质量保证书和鉴定证书。发票上标注的内容应与黄金首饰标签上标注的信息一致。
一、分数标识：
ct分数运用与珠宝首饰，例如采用18k黄金底托材质镶嵌的珠宝首饰;包括：钻石、彩宝、宝石、还有其他玉石种类、杂七杂八高档的石头等等珠宝首饰，都是以分数ct作为标识。采用ct标识的宝石也就是珠宝首饰的分数。100分就是一克拉，一克拉也就是0.2克以此类推。
二、文字标识：
足金、千足金、万足金、足金999、足金999.9等等。或者英文字母带数字AU999、AU999.9、AU990等等。项链的标识通常都打在项链的M扣中间或者两侧。
avc作用什么(avc的主要作用)不会后悔.凭借PSP强大的机能和便携性，简直拥有着无限宽广的发展潜力。作为电子娱乐终端诞生的PSP，游戏功能自不用说，有着接近SONY自家PS2家用游戏机的游戏画面表现；内置硬件MP4解码配合4.3寸16∶9大屏幕观赏AVC高清晰电影也是相当的惬意；支持SONY自家MD所采用的ATRAC3plus高质量音频让它在音乐表现力上也相当出众；支持记忆棒扩展存储媒体，为其发展各种功能提供了充沛的空间；软件爱好者们开发的各种看电子书、看漫画的应用小软件也让PSP变得更加实用；除此以外，PSP内置无线网卡，可以作为小型网络终端，发展VOIP网络电话也将成为未来的一个方向；提供的miniUSB接口还可以用来连接各种扩展设备，摄像头、GPS、Mic、1Seg电视信号接收器……
arctanx与sinx没有什么直接的关系。avctanx指的是在(-π/2，π/2)(正切的主值区间)内正切值等于x的那一个角，是一个唯一的确定的角。而sinx是一个等于x(弧度或角度)的角的正弦，这个正弦的值的大小完全由角x确定。因此本题中的两个概念完全不同，毫无联系。
MISMI米石的挺不错的， 卓越的一体化设计，安装通用型极强，不用担心自己的车子装不上啦，还有AVC双轴承滚珠风扇，强劲风力高效散热等优点。
DGS曲线是描述规则反射体的距离、回波高及当量大小之间关系的曲线。
什么是超声波探伤AVG（DGS）曲线？ AVG=DGS=distance gain size 顾名思义AVG(DGS)是跟缺陷大小、距离、增益有关系 AVG(DGS)曲线——也叫超声波发射声场曲线
1.概念：描述规则反射体的距离、波幅、当量大小之间的关系曲线称为：“距离(A)-波幅(V)-当量(G)曲线”，德文为AVC曲线，英文为DGS曲线。
2.用途：可用于锻件检测时缺陷的面积当量计算。
电压无功自动控制简称AVC,它是电网安全、优质和经济运行的重要手段。针对发电机组励磁系统，通过分散控制系统（DCS）中的软硬件，接受电网调度能量管理系统（EMS）来的电压指令实现相关的调节逻辑，输出脉冲指令来增减励磁电流，改变发电机无功，从而实现电网自动电压控制。
VQC,是指变电站内的电压无功控制装置，最早期的是硬件VQC装置，现在也有软件VQC，只适用于变电站内的电压无功的控制。
VQC---控制孤岛
主要体现在：无法体现不同电压等级分接头调节对电压的影响；不能做到无功分区分层平衡；不包含与省网AVC协调控制的策略
；无法满足某些全网的控制目标以及约束条件:如省网关口功率因数，220kV母线电压约束,全网网损尽量小的目标。
现阶段电压无功控制系统被称之为：AVC系统
1、P：价格 Q：数量 D：需求 S：供给 E：均衡或期望e：弹性 ed：需求的价格弹性 es：供给的价格弹性 exy:需求的交叉价格弹性 U：效用 TU：总效用 MU：边际效用 CS:消费者剩余。
2、MRS：商品的边际替代率 L：劳动力 K：资本 TP:总产量 AP：平均产量 MP:边际产量 MRTS:边际技术替代率 C：成本 STC：短期总成本
3、TFC：总不变成本 TVC：总可变成本 TC：总成本 AFC：平均不变成本 AVC：平均可变成本。
4、AC：平均总成本 MC：边际成本 LTC：长期总成本 LAC：长期平均成本 SAC：短期平均成本。
5、LMC：长期边际成本 SMC：短期边际成本 TR：总收益 AR：平均收益 MR：边际收益 PS：生产者剩余 MP：边际产品 VMP：边际产品价值 W：劳动价格 MRP：边际收益产品 MFC：边际要素成本 r：利率 PEP：价格扩展线。
1、市场––一组为买卖某种商品而相互发生联系的厂商和个人，或指同种商品由供求双方作用形成价格的“地方”。
2、市场结构––指某种商品或劳务在市场上的竞争程度，影响其主要因素：厂商数目多寡和产品的差别程度。
3、完全竞争––纯粹竞争，不存在任何垄断因素的市场情况，不受任何障碍和干扰的市场结构。
4、停止营业点––市场价格为MC与AVC的交点时，只能收回可变成本，是停止营业点。
5、厂商短期供给曲线––完全竞争市场上，MC曲线位于AVC曲线低点以上的部分。
主要有以下几方面： ①据纯音听力图语言频率平均损失计算，阈值在 0～30dB者无需使用助听器。30～45dB者属可用可不用者，根据决定选配。45(或40)～90dB都应建议配用，多数能获得满意结果。90～110dB的效果欠佳，但对婴幼儿童应建议在2～3岁前使用大功率助听器，对利用残余听力发展口语能力有重要意义。 ②自幼为聋哑人，即便其听力为55～70dB，而年龄超过8～12岁再开始使用助听器者多数不会获得满意效果。最迟应在5、6岁前使用助听器才能取得效果。 ③若双耳损失一致，动态范围相近，双耳助听效果最好。 ④双耳听力损失差异大于30dB，应用一耳助听器，可为语言辨别率高和动态范围大的一侧佩戴。 ⑤一耳听力损失小于40dB，而另一耳为60～70dB左右应为后者配用。 ⑥一耳听力损失60～70dB，而另一耳听力损失远大于此值，应为前者配用。 ⑦若双耳听力曲线起伏不一致，应为较平坦一侧配用。 ⑧对老年聋、噪声聋、药物中毒性聋等重振现象阳性患者，说明他们以内耳毛细胞病变损害为主，响度变化的忍耐度减低，应推荐使用带有自动增益控制(AGC)(或AVC、ARC)及PC装置的助听器。 ⑨长期反复发作的功能性聋(癔病聋或神经官能症耳聋)使用助听器效果较好。 ⑩双耳全聋不能配用助听器，但有些国家的学者主张全聋儿童在1、2岁前使用大功率助听器，采用全面交往法有助于发展语言交际能力。一耳全聋，另一耳正常，一般不用助听器，但近来有些国家的一些听力专家主张使用“对侧信号交联(CROS)式”助听器，即在全聋耳上佩戴助听器的传声器，而受话器则使声音导入健耳，有助于收听坏耳一侧来的声信号。双耳听力损失达到70dB以上时，应当配用双耳耳级助听器。为避免引起反馈啸叫，有些国家使用所谓双耳对侧交联(BICROS)式助听器。
AVR-2807:
AVR-2807 110W × 7 (8欧姆，20Hz-20KHz，THD0.05%)
160W × 7 （6欧姆，JEITA）
完全分立均等功率7声道放大器
32bit浮点运算DSP
所有声道24bit/192KHz数/模转换器
纯直通模式和AL24 Plus处理器
完全支持最高级的环绕播放格式
-Dolby Digital EX -Dolby Digital -Dolby Pro Logic IIx -DTS-ES -DTS96/24 -DTS Neo:6 -DTS
新自动设定和视听室均衡器Room EQ，Audyssey的MultEQ
可分配的后环绕（L/R）声道，可用于前置声道（L/R）的双功放或其他区域播放
HDMI数字视频接口支持高品质1080P高品质视频输出
I/P转换从480i（模拟信号输入）到480p（HDMI输出）
音频延时功能（保证声画同步）
3用户模式按钮
特别设计iPod连接（需另购ASD-1R iPod 控制底座）
屏幕显示便于操作
56个AM/FM电台
尺寸：434×171×429
14.0千克
AVC-3808:
型号
AVC-3808
功放系统
AV功放
频响范围
20-20kHz
阻抗
6Ω 纠错
输出声道
7.1
输出功率
180W×7
失真度
0.05%
输入端子
HDMI1.3a,支持遥控
输出端子
AVV对基因的作用(基因CNV)分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对人体状态和疾病作出诊断的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常，以确定受检者有无基因水平的异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。通俗简单的讲所有基于分子生物学水平的方法学技术都属于分子诊断技术，比如PCR技术、基因测序技术等等。
PCR技术即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理类似于DNA的天然复制过程，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性，模板DNA与引物的退火(复性)，引物的延伸。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。简单讲PCR技术本质上是针对DNA片段进行扩增放大，通过实时荧光PCR技术使得样本中DNA含量可以检测出来。
基因测序技术即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。简单讲基因测序技术是针对DNA片段进行测序和分析，使得DNA序列得以清晰。
下面一起来了解一下分子诊断技术近50年的发展历程：
一、基于分子杂交的分子诊断技术
上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20年,由于当时尚无法对样本中靶基因进行人为扩增,人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现,为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。
(一)DNA印迹技术(Southern blot)
Southern[1]于1975年发明了DNA印迹技术,通过限制性内切酶将DNA片段化,再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离,通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上,再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交,经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交,保证了检测的特异性。因此,一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法,广为运用于各种基因突变,如缺失、插入、易位等,及与限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鉴定中。Alwine等[2]于1977年推出基于转印杂交的Northern blot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。
(二)ASO反向斑点杂交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)
使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性,但存在操作极为繁琐,检测时间长的缺点。1980年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法,构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide,ASO),更使对核酸序列点突变的检测成为可能。1986年,Saiki[3]首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来,实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测,Saiki[4]又发明了ASO-RDB,通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色,进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上,只需通过1次杂交反应,即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因,具有操作简单、快速的特点,一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。
(三)荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)
FISH源于以核素标记的原位杂交技术,1977年Rudkin[5]首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪8090年代,细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术,FISH结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势,可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列;由于使用高能量荧光素标记的DNA探针,可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。
如今,FISH已在染色体核型分析,基因扩增、 基因重排、病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。通过比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)与光谱核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技术,使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作用。
(四)多重连接探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)
MLPA技术于2002年由Schouten等[6]首先报道。每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段,1个由化学合成,1个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中,2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,再使用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异,只有当2个探针与靶序列完全杂交,连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有1个碱基的差别,就会导至杂交不完全,使连接反应无法进行。连接反应完成后,用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针,每个探针扩增产物的长度都是唯一的。最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,便可对把核酸序列进行检测。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理,MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进行鉴定。
该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。经过MRC-Holland公司10余年的发展,MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系,是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。
(五)生物芯片
1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研发的光蚀刻技术制备了首个以玻片为载体的微阵列,标志着生物芯片正式成为可实际应用的分子生物学技术。时至今日,芯片技术已经得到了长足的发展,如果按结构对其进行分类,基本可分为基于微阵列(microarray)的杂交芯片与基于微流控(microfluidic)的反应芯片2种。
1.微阵列芯片
(1)固相芯片:微阵列基因组DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯片:将微阵列技术应用于MGDP检测中已有超过十年的历史,其技术平台主要分为2类,即微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型杂交阵列(SNP array)。顾名思义,aCGH芯片使用待测DNA与参比DNA的双色比对来显示两者间的拷贝数变异(CNV)的变化,而单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片则无需与参比DNA进行比较,直接通过杂交信号强度显示待测DNA中的SNP信息。随着技术的不断进步,目前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的高分辨率混合基因阵列芯片。MGDP芯片主要应用于发育迟缓、先天性异常畸形等儿童遗传病的辅助诊断及产前筛查。经验证,使用MGDP芯片进行染色体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达100%[8],表达谱芯片(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]首次使用cDNA芯片绘制了mRNA表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的作用日益得到重视,目前也已出现microRNA芯片、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片等。类似于MGDP芯片,GEP芯片使用反转录后生成的cDNA文库与固定于芯片载体上的核酸探针进行杂交,从而检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。相较于基因组杂交,GEP芯片对生物学意义更为重要的转录组信息进行检测,对疾病的诊断与预后判断具有特殊的意义。目前使用GEP芯片对急性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征等血液病及神经退行性变等进行诊断、分类及预后评估已经获得了令人满意的效果;
(2)液相芯片:传统固相芯片将检测探针锚定于固相载体上捕获目的序列,而Luminex公司的xMAP技术[10]则通过搭配不同比例的2种红色荧光染料,将聚苯乙烯微球标记为不同的荧光色,并对其进行编码得到具有上百种荧光编号的微球。通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联至编码微球上,使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。利用混合后的探针-微球复合物与待测样本进行杂交,使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞仪,其中红色激光检测微球编码,绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度,一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。目前,该技术已在囊性纤维化等遗传性疾病诊断、多种呼吸道病毒鉴定及人乳头瘤病毒分型取得了广泛的应用。
2.微流控芯片
1992年Harrison等[11]首次提出了将毛细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的构想,通过分析设备的微型化与集成化,完成传统分析实验室向芯片上实验室(lab-on-chip)的转变。微流控芯片(microfluidic chip)由微米级流体的管道、反应器等元件构成,与宏观尺寸的分析装置相比,其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比,以最大限度利用液体与物体表面有关的包括层流效应、毛细效应、快速热传导和扩散效应在内的特殊性能,从而在1张芯片上完成样品进样、预处理、分子生物学反应、检测等系列实验过程。
目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。
二、核酸序列测定
测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段,是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展,但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上,因此对基于特定基因序列检测的分子诊断,核酸测序仍是技术上的金标准。
(一)第1代测序
1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法,随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型,为核酸测序时代的来临拉开了序幕。
Sanger等于同年提出的末端终止法(Sanger测序法)利用2'与3'不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应,ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键,DNA合成反应便会终止。如果分别在4个独立的DNA合成反应体系中加入经核素标记的特定ddNTP,则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射自显影,根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。Appied Biosystems公司在Sanger法的基础上,于1986年推出了首台商业化DNA测序仪PRISM 370A,并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检测体系。该公司于1995年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量大大提高。Sanger测序是最为经典的一代测序技术,仍是目前获取核酸序列最为常用的方法。
(二)第2代测序
1.焦磷酸测序(Pyro-sequencing)
不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念,Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相[13]与液相[14]载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。其基本原理是利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光,通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。由于使用了实时荧光监测的概念,焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量,因此在SNP位点检测、等位基因(突变)频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。由于荧光报告原理不同,其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提高到了5%。但由于该技术的仪器采购与单次检测成本较高,目前尚未得到大规模的临床使用。
2.高通量第2代测序
目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD和Life Ion Torrent等,其均为通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应,使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应,完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测,在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。然而,由于该技术需要对DNA进行片段化处理,测序反应读长较短(如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp),需要对数据进行大规模拼接,因此对分子诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求,以利于后期的测序数据分析。
(三)第3代测序
第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术的操作平台目前主要有Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔技术等。该技术进一步降低了成本,可对混杂的基因物质进行单分子检测,故对SNP、CNV的鉴定更具功效。但是目前其进入产品商业化,并最终投入临床应用仍有很长的距离。
三、基于分子构象的分子诊断技术
(一)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)与单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)
1970~1980年间,Fischer等[15]与Orita等[16]分别提出了利用核酸序列变异所导至双链变性条件差异与单链空间折叠差异,通过变性与非变性PAGE对变异序列进行分离鉴定的方法,即DGGE与SSCP。上述2项技术均通过变异核酸分子在空间构象上的差异,通过特定条件下电泳速率的变化进行检测。正因为核酸分子构象具有序列特异性,且对于序列的改变非常敏感,常常1个碱基的变化也能得到鉴定。但由于DGGE与SSCP均必须进行PCR后开盖电泳的操作,现已不常见于临床检测。
(二)变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)
1997年,Oefner和Underhill建立[17,18]了利用异源双链变性分离变异序列、使用色谱洗脱鉴定的技术,称为dHPLC,可自动检测单碱基置换及小片段核苷酸的插入或缺失。对于存在一定比例变异序列的核酸双链混合物,其经过变性和复性过程后,体系内将出现2种双链:一种为同源双链,由野生正义链-野生反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双链;另一种为异源双链,即双链中1条单链为野生型,而另1条为变异型。由于存在部分碱基错配的异源双链 DNA与同源双链DNA的解链特征不同,在相同的部分变性条件下,异源双链因存在错配区而更易变性,被色谱柱保留的时间短于同源双链,故先被洗脱下来,从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行检测,可快速检出<5%负荷的变异序列。但需注意的是,由于该技术主要通过异源双链进行序列变异检测,其不能明显区分野生型与变异型的纯合子。
(三)高分辨率熔解分析(high-resolution melting analysis,HRMA)
2003年,Wittwer等[19]首次革命性地使用过饱和荧光染料将PCR产物全长进行荧光被动标记,再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定。该技术的原理也是通过异源双链进行序列变异鉴定。待测样本经PCR扩增后,若存在序列变异杂合子,则形成异源双链,其熔解温度大大下降。此时由于双链被饱和染料完全填充,其产物熔解温度的变化便可通过熔解曲线的差异得以判定。对于变异纯合子而言,HRMA也可利用其较高的分辨率完成PCR产物单个位点A:T双键配对与G:C三建配对热稳定性差异的鉴定,但是对于Ⅱ、Ⅲ类SNP的纯合子变异则无法有效区分。
如何利用DNA构象对序列进行推测,从而避免成本较高的序列测定或操作繁琐的杂交反应一直是分子生物学研究与应用的热点问题。目前,使用构象变化对序列变异进行间接检测的便捷性已得到一致肯定,尤其是HRMA可完成对变异序列单次闭管的扩增检测反应。但需要注意的是,由于基于构象变化的分子检测手段多无法通过探针杂交或核酸序列测定对检测的特异性进行严格的保证,因此其只适合大规模的初筛,而真正的确诊仍需要进行杂交或测序的验证。
四、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)
相比于其他分子诊断检测技术,qPCR具有2项优势,即核酸扩增和检测在同一个封闭体系中通过荧光信号进行,杜绝了PCR后开盖处理所带来扩增产物的污染;同时通过动态监测荧光信号,可对低拷贝模板进行定量。正是由于上述技术优势,qPCR已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术,在各类病毒、细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。但伴随着qPCR技术的迅猛发展,有关这项技术的质量管理问题也日益突出,如何消除各类生物学变量所引起的检测变异,减少或抑制实验操作与方法学中的各种干扰因素是qPCR技术面临的难题。
(一)实时荧光定量PCR(real-time PCR)
1.双链掺入法
1992年Higuchi等[20-21]通过在PCR反应液中掺入溴乙锭对每个核酸扩增热循环后的荧光强度进行测定,提出了使用荧光强度与热循环数所绘制的核酸扩增曲线,定量反应体系中初始模板的反应动力学(real-time PCR)模型,开创了通过实时闭管检测荧光信号进行核酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA双链,且只有嵌入双链时才释放荧光,在每1次的扩增循环后检测反应管的荧光强度,绘制荧光强度-热循环数的S形核酸扩增曲线,以荧光阈值与扩增曲线的交点在扩增循环数轴上的投影作为循环阈值(Cycle threshold,Ct),则Ct与反应体系中所含初始模板数量呈负指数关系,推断初始模板量。随后Morrison[22]提出了使用高灵敏度的双链染料SYBR Green I进行反应体系中低拷贝模板定量的方法。这一方法操作简便,但由于仅使用扩增引物的序列启动核酸扩增,其产物特异性无法得到充分保证。虽然在实时荧光定量PCR反应后可通过熔解曲线对产物特异性进行检验,但其特异性明显逊于使用荧光探针进行检测,因此双链掺入法并未在临床实践中得到认可。
2.Taqman探针
由于双链掺入法存在特异性较低的问题,1996年Heid[23]综合之前发现的Taq酶的5'核酸酶活性与荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针的概念提出了使用Taqman探针进行qPCR的方法。TaqMan探针的本质是FRET寡核苷酸探针,在探针的5'端标记荧光报告基团,3'端标记荧光淬灭基团,利用Taq酶具有5'3'外切酶活性,在PCR过程中水解与靶序列结合的寡核苷酸探针,使荧光基团得以游离,释放荧光信号。从而使能够与靶序列杂交的探针在扩增过程中释放荧光,通过real-time PCR的原理对其进行定量。由于其超高的特异性与成功的商品化推广,Taqman探针已经成为目前临床使用最为广泛的qPCR方法,其在各种病毒基因定量检测、基因分型、肿瘤相关基因表达检测等方面具有着不可替代的地位。
3.分子信标
同样在1996年,Tyagi等[24] 提出了使用分子信标(moleuclar beacons)进行qPCR的方法,分子信标是5'与3'端分别标记有荧光报告基团与淬灭基团的寡核苷酸探针,其两端具有互补的高GC序列,在qPCR反应液中呈发夹结构,荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移(FRET)而保持静息状态。当PCR反应开始后,茎环结构在变性高温条件下打开,释放荧光;在退火过程中,靶序列特异性探针则与模板杂交保持线性,不能与模板杂交的探针则复性为茎环结构而荧光淬灭,通过检测qPCR体系中退火时的荧光信号强度,便可以real-time PCR原理特异性检测体系中的初始模板浓度。相比于Taqman探针,分子信标使用发卡结构使荧光基团与淬灭基团在空间上紧密结合,大大降低了检测的荧光背景,其检测特异性较Taqman探针更高,更适合等位基因的分型检测。
4.双杂交探针
1997年,Wittwer等[25]发表了使用分别标记荧光供体基团与荧光受体基团的2条相邻寡核苷酸探针进行qPCR的方法。双杂交探针所标记的供体基团和受体基团的激发光谱间具有一定重叠,且2条探针与靶核酸的杂交位置应相互邻近。仅当2条探针与靶基因同时杂交时,供体与受体基因得以接近,从而通过FRET发生能量传递,激发荧光信号,荧光信号强度与反应体系中靶序列DNA含量呈正比。由于使用了2条探针进行靶序列杂交,该方法的特异性比传统单探针检测体系得到了极大地提升。
(二)数字PCR
早在上世纪90年代就出现了使用微流控阵列对单次qPCR反应进行分散检测的概念。基于这一理念,Vgelstein与Kinzter[26]于1999年发表了数字PCR(digital PCR)的方法,对结肠癌患者粪便中的微量 K-RAS基因突变进行了定量。相比于传统的qPCR方法,数字PCR的核心是将qPCR反应进行微球乳糜液化,再将乳糜液分散至芯片的微反应孔中,保证每个反应孔中仅存在≤1个核酸模板。经过PCR后,对每个微反应孔的荧光信号进行检测,存在靶核酸模板的反应孔会释放荧光信号,没有靶模板的反应孔就没有荧光信号,以此推算出原始溶液中待测核酸的浓度。因此,数字PCR是1种检测反应终点荧光信号进行绝对定量的qPCR反应,而非以模板Ct值进行核酸定量的real-time PCR。
经由Quantalife公司开发(已于2011年被BIO-RAD收购)的微滴式数字PCR是首款商品化的数字PCR检测系统,目前已被广泛运用于微量病原微生物基因检测、低负荷遗传序列鉴定、基因拷贝数变异与单细胞基因表达检测等多个临床前沿领域。与传统qPCR相比较,该技术具有超高的灵敏度与精密度,使其成为目前qPCR领域的新星。
五、对未来5年的展望
半个世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。概而言之,在过去的50年中分子诊断技术取得了三大转化与3项提升:即报告信号检测从放射核素标记向荧光标记转化,操作方法由手工操作向全自动化转化,检测分析通量从单一标志物向高通量多组学联合判断转化;检测灵敏度、精密度、特异性的快速提升。
在未来5年中,我国分子诊断事业将迎来两方面的进步。随着卫生监管部门对分子诊断重要性的认识不断深入与越来越多高学历、高素质人才的进入,分子诊断将会出现理念的革命性进步,高通量技术将更多的进入临床的实际应用中。随着技术的进一步发展,传统针对特定基因异常、病原微生物感染鉴定的方法学,也将在检测的各项分析性能与操作便捷程度上取得长足的进步。对于传统人力与时间成本较高的检测方法学,将出现两极分化的态势,即Southern等经典的检测金标准将得到保留;而ASO-RDB等灵敏度、特异性均不能满足实际临床需求的方法将快速被新型技术所取代。最终,分子诊断也必将一改目前仅仅用于病原微生物基因检测与部分遗传性疾病诊断的局面,形成由肿瘤学、遗传学、微生物学、药物基因组学四足鼎立,快速发展的景象。
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cnv是cnⅴ而基因芯片是基因芯片。
CNVseq，即拷贝数变异测序，是一种低深度的全基因组测序，可一次性分析23对染色体非整倍体以及大于100 kb的染色体拷贝数变异，目的是用来筛选符合患者临床的染色体变异。大地同年CNV-seq采用可减少扩增偏好性PCR-free建库方式，其人类全基因组测序单端reads 5M以上，原始数据Q30>85%, 过滤后数据Q30 >90%，全基因组覆盖度>0.1X， 可交付测序原始数据.fastq.gz文件。
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