本文导读目录：
1、pcr反应体系各成分作用(pcr反应体系各成分作用是什么)
2、pcr反应缓冲液的作用(pcr反应常用的缓冲体系是什么)
pcr反应体系各成分作用(pcr反应体系各成分作用是什么)PCR反应体系由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系组成。
设计PCR引物时的一般原则：
(1)引物长度一般15~ 30碱基，过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。
(2) 避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。
(3) G/C 和A/T 碱基均匀分布，G/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。
(4) 要避免两个引物间特别是3' 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3' 末端的序列互补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。
(5) 引物3' 端碱基一般应与模板严格配对，并且3' 端为G、C 或T 时引发效率较高。
PCR 反应体系主要由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA 聚合酶、靶序列DNA 和PCR 反应缓冲液体系组成。
设计PCR 引物时的一般原则
(1)引物长度- 一般15~ 30碱基，过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有
效扩增。
(2) 避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。
(3) G/C 和A/T 碱基均匀分布，G/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选
择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。
(4) 要避免两个引物间特别是3' 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3' 末端的序列互
补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。
(5) 引物3' 端碱基一般应与模板严格配对，并且3' 端为G、C 或T 时引发效率较高。
(6) 引物5' 端碱基可不与模板匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性内切酶的识别
位点、ATG 起始密码子或启动子序列等)。这些与原初模板并不配对的非互补序列在后续的循
不中将被带到双链DNA 中去，这样反应产物不仅含有目的序列，同时在目的基因两侧又有了
的限制酶切位点，用相应的限制酶切割后即可将PCR 产物定向克隆到载体中。
PCR反应体系：
1. 缓冲液
标准的缓冲液含 1pmol/ml Tris ·HCl，其 pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+。
2.dNTP
脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 等在内的统称，即合成新的 DNA 链的材料。4 种 dNTP 的浓度相等，总浓度一般为 200pmol/ml （即饱和浓度）。dNTP 可与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度下降，影响 DNA 聚合酶的活性。
3. 引物
引物是一段短的单链 DNA 片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA 聚合酶可由其 3′端开始合成新的核酸链。引物长度一般以 18～30bp 为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。
4. 模板
模板是一段单链或者双链 DNA，提供用于进行 PCR 扩增的原始信息。对模板的纯度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白等。模板 DNA 应该尽量保持低温保存。
5.Taq DNA 聚合酶
Taq DNA 聚合酶以 DNA 为复制模板，从将 DNA 由 5' 端点开始复制到 3' 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成（在具备模板、引物、dNTP 等的情况下）及其相辅的活性。必须一直保存于－20℃，内含甘油保存。最适反应温度 72 ℃，即延伸温度。通常在配制 PCR 体系的最后加入。
溴酚蓝，作为指示溶液前沿的。2×Taq PCR MasterMix已经预混了PCR反应体系中试剂以及电泳时所需loading buffer的成分。溴酚蓝，英文名称为Bromophenol Blue，中文别名为四溴苯酚磺酞，CAS号为115-39-9，分子式为C19H10Br4O5S，为浅黄色至棕黄色粉末，需储存于阴凉、通风的地放，远离火种、热源，用作酸碱指示剂，pH变色范围3.0（黄色）～4.6（紫色），避免与强氧化物接触。
1、DND聚合酶——又称DNA依赖的DNA聚合酶
它是以DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。DNA聚合酶根据聚合酶活力特征和外切酶活性特征的不同，有可以分为多种。在IVD领域中比较常见的酶如下：
Taq DNA聚合酶——Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子量65kD，从Thermus aquaticus中分离出来，是目前科研和分子诊断试剂盒里最为广泛应用的聚合酶。为了更优化PCR反应体系，Taq DNA 聚合酶被进行了一系列的性能提升和优化，其中最为熟知的就是热启动Taq酶.
热启动Taq酶：该酶被进行了化学修饰、抗体修饰或者配体修饰。无论是哪种修饰，其原理都是：在反应体系加热至高温之前，Taq DNA 聚合酶活性被“修饰”抑制，进而抑制低温条件下的非特异性扩增。另外，还有一系列突变体Taq DNA聚合酶被筛选出来以满足耐镁离子、耐盐、高保真等要求。
Bst链置换DNA聚合酶——Bst DNA聚合酶是来源于 Bacillus stearothermophilus的DNAPolymerase I，经基因工程改造去除了其 5’-3’核酸外切酶活性，但保留了 5’-3’ DNA 聚合酶活性和强链置换活性。同时，该酶在扩增速度、产量、耐盐性和热稳定性等方面均有大幅提高，而且增加了dUTP耐受性，非常适合于防污染的等温扩增反应，如 LAMP 等。
由于此次新冠的影响，Bst成为IVD领域内又一个DNA聚合酶宠儿。
除了Bst外，还有其他类似功能的链置换DNA聚合酶，如如Bca best聚合酶、 Klenow聚合酶、phi29DNA聚合酶等。
Tth DNA聚合酶——Tth DNA聚合酶来自Thermus thermophilus HB8，其最有趣的现象是：在Mg2+条件下，Tth DNA聚合酶具有较强的DNA聚合酶活性。在Mn2+条件下，Tth DNA聚合酶具有更强的反转录活性。这一特性使得Tth DNA聚合酶搭配相应的buffer可以同时对DNA模板和RNA模板进行扩增。
2、逆转录酶——又称为RNA依赖的DNA 聚合酶
该酶以RNA为模板，按5'-3'方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA (complementary DNA，CDNA)。最常用的逆转录酶为M-MLV和AMV。
3、RNA聚合酶——一条DNA链或RNA为模板的聚合酶
也称为转录酶。最为常见的是T7 RNA聚合酶，分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。目前体外诊断中，SAT技术中会看到RNA 聚合酶的身影。如仁度、中帜的RNA扩增方法中就需要使用RNA聚合酶。
4、蛋白酶K——能够酶解样本中的各类蛋白质的酶
蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，在较广的pH范围（4?12.5)内及高温 (50?70°C)下均有活性，EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。用于质粒或基因组DNA、RNA的分离和抽提。在病毒核酸检测中，蛋白酶K是病毒采样液中的重要组分之一，蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活，同时将病毒基因组释放以便后续进行核酸抽提。
5、UDG酶——高效控制PCR残余污染
尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），这种酶也称为尿嘧啶 -N- 糖基化酶或UNG酶。
因PCR是一种极敏感的扩增技术，易受污染的影响。小量的外源 DNA 污染可以与目的模板一块被扩增。卫生部明确规定，凡是用于临床检验的PCR试剂，都应该有UNG酶技术，以防止污染。由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
UDG酶的作用原理：在PCR产物或引物中用dU代替dT或者。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
热敏性UDG: 除了常规UDG外，现在也开发出热敏型UDG，热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的的重组蛋白，又称南极热敏UDG，热敏型UDG在50℃ 5min即完全失活。大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶较为耐热，经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，导致含有dU碱基的PCR产物的降解。
6、限制性核酸内切酶——识别并剪切特定的脱氧核苷酸序列
限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。
常用的酶，如BsoB I, Hinc II，Nt.BstNBI切刻内切酶。其中，BD公司的链置换扩增术(stranddisplacement amplification,SDA)等温PCR系统中选择的酶需具有切割位点专一性，且对识别位点的化学修饰敏感。新冠疫情中Abbott 的明星产品ID NOW等温PCR系统中，就采用Nt.BstNBI内切酶。
7、解旋酶，helicase——使双链DNA变成单链DNA
利用ATP水解提供的能量来解开双链DNA核苷酸配对形成的氢键，从而形成单链DNA；
常用解旋酶：大肠杆菌的UvrD和T7噬菌体的gp4；大肠杆菌解旋酶II（UvrD），其解链速度是20bp/s，对反应速度有很大的制约性。T7噬菌体的解旋酶gp4解旋酶的解链速度更快，可达400bp/s，可以大大提高反应速度。
目前，Quidel等温PCR系统HAD中采用此酶
pcr反应的扩增体系配置需要按照试剂说明书的规定严格配置才行，扩增体系里面有大量的酶，必需的离子，dntp等物质，如果随意改变比例，可能导致pcr扩增过程中突然停止，或者非特异性扩增，甚至出现假阳性，假阴性的情况。
pcr反应缓冲液的作用(pcr反应常用的缓冲体系是什么)缓冲液有聚合酶需要的镁离子，还可以使反应体系处于酶反应时适合的PH，实际上就是给酶创造一个最适合的反应环境以使它的活性能达到最佳状态，如果你不加buffer，酶是没有活性的。一般酶和缓冲液是配套的，买酶的时候是在一起的
buffer是缓冲液，增强酶的稳定性，提高酶反应效率。一般配体系都是总量是buffer量的10倍，10x buffer正好是稀释10倍达到额定用量，也有时候是5倍稀释的量。
1、PCR反应体系不包括RNA酶。
2、PCR 反应体系主要由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA 聚合酶、靶序列DNA 和PCR 反应缓冲液体系组成。
3、PCR是聚合酶链式反应的简称，设计PCR引物时的一般原则要求之一是引物长度一般在15～30碱基，过短叫特异性低，过长影响有效扩增。
PCR反应循环参数是指在聚合酶链式反应中，循环参数中退火温度和时间、延伸时间及PCR缓冲液的成分影响多重PCR的扩增效果，而反应体积、循环次数对其扩增效果影响较小。
多重PCR(mutiplex PCR)技术因具有高效、高产率、能降低实验成本、加速实验进程等优点，要求不同引物能在同一反应体系中进行特异性扩增, 因而影响其扩增效果的因素较多, 主要有循环参数、反应体积、反应体系、引物间的碱基配对等。
需要，因为PCR缓冲液就是给PCR反应提供的一个最适酶催反应条件。例如缓冲液中的镁离子在酶催化过程中，结合到酶－底物结合体上，从而使催化反应的活化能更加降低。使得反应能够进行。PH缓冲液是保证PCR反应正常进行的关键条件之一。
PCR反应的缓冲液的作用是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。
负压好，绝对负压（避免室内潜在污染外泄）
每个PCR核酸检测实验室设计布局SICOLAB：
1、平面布局：不论是组合式还是分散式布置的PCR实验室，各功能房间均宜设置独立缓冲间
2、区域空气流向：为避免交叉污染，PCR实验室空气流向必须严格遵循单一方向进行，即智能从试剂贮存和准备区—标本制备区—扩增反应混合物配制和扩增区—扩增产物分析区。
3、通风空调：为避免交叉污染，各功能用房的空气不能掺混。
4、混合式PCR实验室宜采用全新风直流式空调系统；当采用全新风系统有困难时，每区的
空气只能在其室内自循环。
PCR 反应体系主要由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA 聚合酶、靶序列DNA 和PCR 反应缓冲液体系组成
设计PCR 引物时的一般原则
(1)引物长度- 一般15~ 30碱基，过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有
效扩增。
(2) 避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。
(3) G/C 和A/T 碱基均匀分布，G/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选
择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。
(4) 要避免两个引物间特别是3' 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3' 末端的序列互
补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。
(5) 引物3' 端碱基一般应与模板严格配对，并且3' 端为G、C 或T 时引发效率较高。
(6) 引物5' 端碱基可不与模板匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性内切酶的识别
PCR实验室中缓冲间的功能是“控制空气的流向”。
实验室建立要注意以下，
1. 要有紧连PCR实验室的高压灭菌锅。
2. PCR实验室内每个房间的所有进、出风口均需加装高效过滤器。
3. 标本处理间必须配备A2生物安全柜和通风橱并有外连，外连出口需加高效过滤膜。
4. PCR实验室的压力梯度，从高到低单一流向：试剂制备区--标本制备区--扩增区--产物分析区，建议调整为：试剂制备区+10pa＞标本制备区0pa＞扩增区—10pa＞产物分析区—15pa～—20pa。缓冲间压力梯度为 试剂制备区—10pa、标本制备区—10pa、扩增区—5pa、产物分析区—10pa。
PCR具有高度的特异性与灵敏度，受反应体系中各元素及反应条件的影响。主要影响元素是PCR反应体系中的模板、引物、酶促反应原料、酶、及反应的缓冲体系，反应条件主要包括PCR各过程的温度、时间和循环次数等。其次是PCR反应的总体积和PCR反应的促进剂及人员操作技术等元素。
PCR 反应体系主要由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA 聚合酶、靶序列DNA 和PCR 反应缓冲液体系组成。
设计PCR 引物时的一般原则
(1)引物长度- 一般15~ 30碱基，过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有
效扩增。
(2) 避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。
(3) G/C 和A/T 碱基均匀分布，G/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选
择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。
(4) 要避免两个引物间特别是3' 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3' 末端的序列互
补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。
(5) 引物3' 端碱基一般应与模板严格配对，并且3' 端为G、C 或T 时引发效率较高。
pcr各试剂缓冲液作用(pcr缓冲液的作用)PCR实验室中缓冲间的功能是“控制空气的流向”。
实验室建立要注意以下，
1. 要有紧连PCR实验室的高压灭菌锅。
2. PCR实验室内每个房间的所有进、出风口均需加装高效过滤器。
3. 标本处理间必须配备A2生物安全柜和通风橱并有外连，外连出口需加高效过滤膜。
4. PCR实验室的压力梯度，从高到低单一流向：试剂制备区--标本制备区--扩增区--产物分析区，建议调整为：试剂制备区+10pa＞标本制备区0pa＞扩增区—10pa＞产物分析区—15pa～—20pa。缓冲间压力梯度为 试剂制备区—10pa、标本制备区—10pa、扩增区—5pa、产物分析区—10pa。
包含PCR 反应缓冲液、SYBR GreenⅠ染料、ROX、dNTPs、Mg2+ AmpErase UNG及GeneCore Taq Gold HS DNA Polymaras的2×混合液
PCR反应体系由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系组成。
设计PCR引物时的一般原则：
(1)引物长度一般15~ 30碱基，过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。
(2) 避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。
(3) G/C 和A/T 碱基均匀分布，G/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。
(4) 要避免两个引物间特别是3' 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3' 末端的序列互补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。
(5) 引物3' 端碱基一般应与模板严格配对，并且3' 端为G、C 或T 时引发效率较高。
上样缓冲液中甘油与溴酚蓝的左右分别是① 上样缓冲液中包括甘油,溴酚蓝,SDS等,甘油主要作用是防止样品漂浮出点样孔,溴酚蓝作为电泳指示剂,用来观察电泳进度,SDS用于一些核酸结合蛋白的变性解离.②核酸染料与凝胶中核酸结合,以便于在紫外光下显示核酸条带.
PCR反应循环参数是指在聚合酶链式反应中，循环参数中退火温度和时间、延伸时间及PCR缓冲液的成分影响多重PCR的扩增效果，而反应体积、循环次数对其扩增效果影响较小。
多重PCR(mutiplex PCR)技术因具有高效、高产率、能降低实验成本、加速实验进程等优点，要求不同引物能在同一反应体系中进行特异性扩增, 因而影响其扩增效果的因素较多, 主要有循环参数、反应体积、反应体系、引物间的碱基配对等。
pcr需要的原料有:物(PCR引物为DNA片段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液。 PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右)
PCR反应需要加镁离子，并且镁离子浓度的总量应该比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L。 镁离子是加在PCR反应的缓冲液中的，成分是最复杂的，除水外一般包括四个有效成分：
1、缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；
2、一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；
3、二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；
4、辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。 缓冲液的目的是提供合适的酸碱度与某些离子，而PCR反应五要素是：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。
PCR反应体系：
1. 缓冲液
标准的缓冲液含 1pmol/ml Tris ·HCl，其 pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+。
2.dNTP
脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 等在内的统称，即合成新的 DNA 链的材料。4 种 dNTP 的浓度相等，总浓度一般为 200pmol/ml （即饱和浓度）。dNTP 可与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度下降，影响 DNA 聚合酶的活性。
3. 引物
引物是一段短的单链 DNA 片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA 聚合酶可由其 3′端开始合成新的核酸链。引物长度一般以 18～30bp 为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。
4. 模板
模板是一段单链或者双链 DNA，提供用于进行 PCR 扩增的原始信息。对模板的纯度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白等。模板 DNA 应该尽量保持低温保存。
5.Taq DNA 聚合酶
Taq DNA 聚合酶以 DNA 为复制模板，从将 DNA 由 5' 端点开始复制到 3' 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成（在具备模板、引物、dNTP 等的情况下）及其相辅的活性。必须一直保存于－20℃，内含甘油保存。最适反应温度 72 ℃，即延伸温度。通常在配制 PCR 体系的最后加入。
从原理上讲，所有防止污染源的房间均应设置为正压，以避免外部污染源的入侵。比如常规的无菌检测室、超净工作台等遵循的就是正压原则；所有产生污染源的房间均应设置为负压，以防止内部污染源的扩散，如特殊的生物安全实验室、PCR扩增室等都应设置为负压。通风柜和生物安全柜遵循的就是负压原则。
核酸扩增和产物分析主操作间和缓冲间设置为负压，以防止扩增与电泳操作过程中产生的气溶胶会在开门过程中扩散到走廊，进而扩散到试剂准备室和样品处理室而导致结果的假阳性。
PCR反应中缓冲液是一个重要的影响因素，特别是其中的Mg2+能影响反应的特异性和扩增片段的产率。目前最为常用的缓冲体系为l0～50mmol／L的Tris—HCl(pH8．2～8．3，20℃)，PCR标准缓冲液含有10mmol／L的Tris—HCl(pH8．3)、50mmol／L的KCl、1．5mmol／L的Mg2+、0.1g／L的明胶。在一般的PCR反应中，1．5～2．0μmol／L Mg2+是比较合适的(对应dNTP浓度为200μmol／L左右)。Mg2+过量能增加非特异扩增并影响产率。
pcr后延伸的作用(pcr后延伸的作用有哪些)根据扩增产物的长度来确定，一般的酶一分钟延伸1000bp左右，可以据此推算。
pcr步骤是预变性，变性，复性，延伸，循环，然后是72℃ 10min，最后一步是4～15℃，永久保存。
PCR的延伸温度是由引物来决定的，引物的长短、GC的含量都会影响到退火温度
预变性是使引物完全变性解开，从而保证引物为单链DNA，从而保证效果 最后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构以保证效果
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物
PCR扩增仪
延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。
在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用， 如RT-PCR、竞争PCR、槽式PCR、RAPf)、ARDRA等。
重要，最后一个循环模板量最多，延伸的时间需要延长一点，这样可以保证PCR反应完全，模板浓度区域正常水平。这个问题比较好理解，因为在循环结束后，体系中的taq酶可能很多正处于复制状态，如果此时降到室温，将会影响最终产率。所以再留出5分钟，以使正在复制中的taq酶能够复制完全，以合成更多的目的分子。
和taq酶和所扩增的片段长短有关。
pcr的延伸就是当引物结合到模板上时，会在聚合酶的作用下进行延伸扩增，目前市面上不同的商品化聚合酶延伸速度不一样，一般的聚合酶延伸速度在30-60s/kb，有些快速的taq酶扩增速度可以达到几秒/kb，所以不同taq酶延伸速度不一样，所设置的延伸时间也就不一样，同理扩增不同长度的片段延伸的时间也就不同，通常是扩增片段越长延伸时间越长。
再次延伸，代表前一次延伸的长度不够，必须进行再次厌延伸，以确保目的条带能够批出来。
PCR基本原理:
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物 延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。
在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用， 如RT-PCR、竞争PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。
步骤：
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
模板DNA的变性
模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
模板DNA与引 物的退火(复性)
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
引物的延伸
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
拓展资料
聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction） (又称：多聚酶链式反应) PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
一、PCR技术基本原理有：
1、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
2、PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
二、PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。
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