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人参 阿胶(人参 附子)
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本文导读目录： 1、人参 阿胶 2、人参 附子 3、人参 鹿茸
单味功用概要：
人参： 见解表类。阿胶： 见止咳类。
伍用功效：
人参甘温，归脾肺二经，功长补气健脾益肺，脾肺气虚
为常用之品。阿胶甘平，归肺肝肾经，功偏补血滋阴，益肾
润肺柔肝。二药合用，一则以阿胶滋水生金，人参益气保肺，
合奏滋肾润肺之效;一则以人参健脾扶中，阿胶养血柔肝，共
奏健脾柔肝、养血止血之功。
表12-1-1 参附注射液中钙盐镁盐含量测定结果 表12-1-2 7批参附注射液中人参皂苷含量测定结果 表12-1-3 6批参附注射液中乌头类生物碱含量测定结果 表12-1-4 U9(91×33)均匀设计表 表12-1-5 综合各指标成分含量及标准化处理结果 g·100g-1 表12-1-6 对大鼠心肌膜ATP酶活性的影响 表12-1-7 参附注射液对大鼠心肌膜ATP酶活性的影响 表12-1-8 人参总皂苷、附子总碱混合液对心肌膜ATP酶活性的影响 表12-1-9 参附注射液对狗LAD结扎后NST↑↓和ΣST↑↓的影响 表12-1-10 参附青预防滴注对大鼠血浆6-Keto-PGF1α、TXB2及其比值的影响(±) 表12-1-11 参附青治疗对大鼠血浆6-Keto-PGF1α、TXB2及其比值的影响(x±s) 表12-1-12 各组大鼠血浆cAMP、cGMP浓度(x±s) 表12-1-13 人参、附子与参附汤对小鼠脾淋巴细胞产生IL-2的影响 表12-1-14 人参、附子与参附汤对小鼠混合脾淋巴细胞产生IL-2的影响 表12-1-15 参附汤对失血性休克大鼠血浆Gc和肝胞液GcR结合活性的影响(±s) 表12-1-16 参附汤对阳虚大鼠体重、体温、耗氧量的影响(x±s) 表12-1-17 各组大鼠甲状腺滤泡变化的比较(x±s)
单味功用概要：
人参： 见解表类。
鹿茸： 补肾阳，益精血，强筋骨。本品甘温，大补肝肾，
肾藏精主骨，肝藏血主筋，故能壮肾阳，益精血，强筋骨，并
能温养督脉而固冲任。因此，凡肾阳不足，精血亏虚，畏寒
乏力，眩晕耳鸣，四肢痿软，腰痛尿频，阳痿遗精，女子不
孕，以及小儿行迟齿迟等症，皆有峻补元阳，增进体力，强
健筋骨之效。对阳虚血少冲任不固之崩漏证，亦常与其他补
养、止血药同用。此外，对阴疽溃久脓清不敛之症，亦有温
补内托之功。
伍用功效：
人参甘温，大补元气。鹿茸甘温，峻补肾阳，益精血，强
筋骨。“形不足者温之以气，”人参大补元气，鹿茸温命门之
火，以生少火之气; “精不足者补之以味”，鹿茸味厚，益精
血，强筋骨，得人参以生津，其源不竭。此二药相合，虽有
气血阴阳兼顾之施，但终以益气壮阳为最，其力刚雄，为峻
补之品。
人参 阿胶 ♂
人参 阿胶
人参 附子 ♂
人参 附子
1.人参 附子 : 【中医理论】
人参半两(1.5g)、附子(炮,去皮脐)一两(3g),作三服,加生姜十片,水煎服,《医方类聚》卷一五O引《济生续方》[1],称参附汤,《古今医统》卷二十二又称“附参汤”,具有益气回阳固脱之功,主治元气大亏,阳气暴脱,汗出厥逆,喘促脉微,欲绝之危在顷刻者。人参甘平,大补元气,补脾益肺,生津安神;附子辛热,回阳救逆,温肾助阳,祛寒止痛。人参以补气强心为主,附子以助阳强心为要。二药伍用,相互促进,温阳益气,回阳救逆之力增强。正如《医宗金鑑》谓:“补后天之气无如人参,补先天之气无如附子,此参附汤之所由立也。二脏虚之微甚,参附量为君主。二药相须,用之得当,则能瞬息化气于乌有之乡,顷刻生阳于命门之内,方之最神捷者也。”《血证论》又谓:“人之元气,生于肾而出于肺,肺阳不能制节,肾阳不能归根,则为喘腹之证,用附子入肾以补阳气之根,用人参入肺以济生气之主,二药相济,大补之气,气为水为阳,水即气之阴,人参是补气之阴,附子是补火之阳,知此,则知一切补气之法。”
人参、附子配伍在理论上探讨主要集中在如下两个方面。
1.量随证变,治有主次
药量是决定方中药物药力大小的重要因素,改变药物的用量配比,使之量随证变,以便切合病证,增强疗效。《校注妇人良方》之参附汤重用人参,参附之比为2:1,意在加大补气、生津、固脱之力。《正体类要》治金疮、杖疮,失血过多,阳随阴走者。用人参四钱,炮附子三钱,水煎服,阳气脱陷者倍用之。方中调整了参、附用量比例,以增强峻补阳气,回阳固脱之力。《圣济总录》卷四十四的“附子汤”,乃参附汤之变方,以人参、附子等分,益气补中与温肾助阳并重,治脾肾虚寒,不时易泻,腹痛,阳痿,怯寒等证,有补火壮阳,火能生土之用。《医宗金鉴》用参附汤治风邪中脏,形气俱虚,其证唇缓不收,痰涎流出,神昏不清,身肢偏废,或与五脏脱证并现者,则“大倍人参,先固虚脱”,寓“无形之气所当急固”之妙义。一俟气旺厥回神清,病情稳定,次治风邪,此即病有急缓,治有主次。《辨证录》卷三之“独参汤”则以人参三两,附子三分组方,以独重人参为君药,而得名,以与“参附汤”相区别。煎汤灌服,用治久痢之后,下多之阴,阴虚而阳暴绝之昏作,小便自遗,汗大出不止之急症。重用人参大补元气,佐附子温阳补火,实为救逆之良方。阳回则阴液身化,庶有生机矣。
2.剂型变更,病有缓急
病有缓急轻重,治当分清峻补与缓养,适当地改变剂型,使其更能切合病情。如《景岳全书》参附汤,缓慢温补方可奏效,不急于求其速效于一时,故以参、附各等分。炼白蜜丸如绿豆大,每用白开水送下三五分或一钱。是方改汤为丸,使其药峻而力缓,药效慢而持久。参附汤对多种休克均有较好疗效,对心源性休克、感染中毒性休克疗效更佳。剂型改为注射液较汤剂应用更为安全、方便,起效更为快速,疗效亦大为提高。如常用制剂参附注射液,静脉滴注,有益气活血,回阳救脱,强心生脉之效,用于元气大亏,阳气暴脱,手足厥冷,呼吸微弱,脉微及心源性休克、感染性休克、中毒性休克、创伤性休克等。
总之,参附汤为益气回阳之有效方剂,历代医家在其基础上灵活化裁,因证施方,使其更富针对性和实用性,对于临床有效地运用该方和研制开发新药均有可借鉴之处。
【药理研究】
1.理化鉴别[2]
取本品2ml置具塞试管中,用力振摇1min,产生多量蜂窝状泡沫,放置10min,泡沫无显著消失。
取本品约2ml,分别置于两支小试管中,加0.5ml稀盐酸,分别加碘化铋钾试液(或碘化汞钾)或碘化铋钾试液即发生棕色沉淀或黄色沉淀。
取本品1ml,置小蒸发皿中,于水浴上蒸干,滴加醋酐0.5ml,使溶解,移入小试管中,沿壁加浓硫酸约0.5ml,两液交界面呈现棕红色环。
2.人参、附片的薄层层析鉴别[2]
供试品液的制备:取本品5ml,置水浴上蒸干,残留物加95%乙醇约1ml,搅拌使溶解,备用。对照品液的制备:分别取按同一工艺制成的单味药人参、附子注射液各5ml,置水浴上蒸干,残留物加95%乙醇约1ml,搅拌使溶解,备用。
操作方法:吸取供试品液、人参注射液对照品液或供试品液、附片注射液对照品液,点样3～8μl于同一块硅胶G薄层板上,用氯仿-甲醇-水(65:35:10或80:20:2)作展开剂,喷洒10%硫酸乙醇液显色,所呈紫红色斑点不得少于7个;或喷洒稀碘化铋钾试液与碘化铋钾试液(1:1)混合液。供试品液与附片注射液对照品液的层析谱基本一致。所呈现黄色色斑不得少于4个。
3.限量检查
3.1 乌头碱限量的薄层层析检查[2]
供试品液的制备:取本品10ml,置水浴上蒸干,残留物加95%乙醇1ml,搅拌使溶解,移入2ml容量瓶中,用乙醇稀释至刻度,摇匀,备用。乌头碱标准液的制备:精密称取乌头碱标准品(USP X.E Merck)2mg,加95%乙醇使溶解,移入10ml容量瓶中,用乙醇稀释至刻度,摇匀,备用。薄层层析条件:采用硅胶G为吸附剂,展开剂以乙醚-氯仿-甲醇(1:2:1)或苯-醋酸乙酯-二乙胺(7:2:1)效果为佳。喷洒稀碘化铋钾试液与碘化钾试液(1:1)混合液为显色剂。按上述层析条件实验,结果表明:乌头碱0.4μg呈现可见色斑,0.6μg即呈现明显的色斑。用微量进样器分别吸取供试品液及乌头碱标准液,分别点样供试品液20μl,乌头碱标准液3μl、5μl于同一块硅胶G板上,依上述方法展开、显色后,供试品液层析谱与乌头碱Rf值相应的位置不呈现色斑或所呈现的色斑不得比乌头碱标准液3μl呈现的色斑更深。
3.2 钙盐及镁盐的限量检查[2]
附片系附子的炮制品,炮制过程经盐卤浸渍、蒸煮等。引入钙盐、镁盐等皆具有生理活性,其量也因炮制方法不同而有差异。
测定方法:精密吸取本品5～10ml,加蒸馏水5ml,加氨-氯化铵缓冲液(pH10)2ml,铬黑T指示剂(固体粉末)适量,用0.02mol/L乙二胺四醋酸二钠液滴定,至紫红色转变为纯蓝色,即达终点。由消耗0.02mol/L乙二胺四醋酸二钠液的量计算求得钙盐及镁盐的总量。
精密吸取本品5～10ml,加蒸馏水5ml,加10%氢氧化钠溶液使溶液至pH12以上,加指示剂适量,用0.02mol/L乙二胺四醋酸二钠液滴定至粉红色转变为纯蓝色,20sec不返红色,即达终点。由消耗0.02mol/L乙二胺四醋酸二钠液的量计算得钙盐含量。再用减差法计算求出镁盐含量。结果如表12-1-1。
4.1 人参总皂苷的含量测定(比色法)
方法1[2]
标准曲线的绘制:精密称取人参二醇标准品约5mg,加甲醇溶解,移入5ml容量瓶中并稀释至刻度。精密吸取10、20、30、40、50、60μl,置玻塞试管中,用热风挥去溶剂,加5%香荚醛-冰醋酸溶液(新配制)0.2ml、高氯酸0.8ml,于60℃恒温水浴上加热15min,立即置冰浴内,冷却,加冰醋酸5ml,摇匀,于560nm处测定吸收度。同时,以试剂作空白试验。测得的吸收度经统计学直线回归分析处理,得回归方程式,以校正值绘制浓度-吸收度曲线。回归方程式:
A=0.008+8.696C,r=0.9995。
供试品测定:精密吸取本品10ml,于水浴上蒸干,残留物加甲醇分数次充分搅拌使溶解,并移入5ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。精密吸取供试品溶液20～30μl(相当人参总皂苷约100μg),置具塞试管中,用热风挥去溶剂,依标准曲线项下操作测定吸收度,测得吸收度查标准曲线求出相当的人参二醇量,按下式计算求出人参总皂苷含量。
C:相当人参二醇量(mg);V:点样量(ml);2.5:人参二醇皂苷元组皂苷平均分子量与人参二醇分子量之比。
回收率试验:精密称取人参(根)总皂苷对照品一定量各两份,加附片注射液使溶解,并分别移入10ml容量瓶中,加附片注射液至刻度,摇匀,即得已知人参总皂苷含量的参附注射液。依上述方法测定其人参总皂苷含量。回收率为100.9±2.88%～102.6±1.90%。
不同批号注射液中人参总皂苷的含量测定,结果如表12-1-2。
标准曲线的制备:精密称取人参二醇标准品约2mg,置1ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度。用微量进样器吸取15、25、35、45、55μl,置干燥具塞试管中,挥干溶剂。加入新配制的5%香荚醛冰醋酸溶液0.2ml,高氯酸0.8ml,摇匀,密塞,置60℃恒温水浴中加热15min,立即以流水冷却,加冰醋酸5ml,混匀,于560nm处测定吸收度,随行空白,绘制浓度-吸收度曲线。供试品液制备:精确量取样品溶液2份(每份相当人参生药1 g),分别置于50ml分液漏斗中,以乙醚脱脂4次(15ml×1,10ml×3),醚层用少量水洗涤,将洗涤水并入水层中,水层再用水饱和的正丁醇萃取5次(15ml×1,10ml×4),弃去水层,正丁醇层用少量水萃取1次,水层再用正丁醇萃取1次,弃去水层,合并正丁醇液,减压回收正丁醇至干。残留物以少量甲醇溶解,仔细地移到2ml容量瓶中,稀释至刻度。
薄层层析:吸附剂为硅胶G。展开剂用氯仿-甲醇-水(70:55:10),并于层析缸内放入盛有少许定量冰醋酸的小杯。显色剂为碘蒸气。待皂苷显黄色斑点,立即取出,描记出斑点位置。
比色测定:将皂苷斑点刮入磨口带塞试管中,并取与色斑相当量的前沿硅胶为空白,同标准曲线显色,离心分离,吸取上清液置比色皿中,于560nm处比色测定。测得吸收值,查人参二醇标准曲线求出相当人参二醇的微克数,计算人参皂苷含量,供试品中人参皂苷含量(%)=测得吸收值相当人参二醇的微克数(A)×2.5×100/取样品量相当于生药的微克数(W)。
4.2 乌头类生物碱的含量测定(离子对萃取-分光光度法)[2]
标准曲线的绘制:精密称取乌头碱标准品12.97mg,加1N盐酸数滴使溶解,移入100ml容量瓶中,加水至刻度,摇匀,即得。每ml含乌头碱0.1297mg。精密量取乌头碱标准液0.5、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00ml,分别置于分液漏斗中,各加入蒸馏水2.50、2.00、1.75、1.50、1.25、1.00ml,加pH6的邻苯二甲酸氢钾缓冲液5.0ml、溴麝香草酚蓝指示液2.0ml、氯仿10.0ml,振摇3min,静置1h,分取氯仿液,过滤。同法以蒸馏水3.0ml作空白试验。用751型分光光度计,于410nm处测定吸收度。测得的吸收度经统计学回归分析处理,得回归方程式,A=0.0058+2.952C,r=0.9992。以校正值绘制浓度-吸收度曲线。
供试品的测定:取安瓿(2ml)10支,倾出注射液,混匀。精密量取10.0ml,加氨试液调至pH10～11,用氯仿萃取5次,收集氯仿液,回收氯仿后,残留物加少许盐酸使溶解,移入10ml容量瓶中,加水至刻度,摇匀,备用。精密量取供试液2.0ml,依上法测定。测得的吸收度查标准曲线求出相当乌头碱量。按下式计算乌头类生物碱含量。
C:相当乌头碱量(mg);0.9349:换算因素为乌头次碱分子量与乌头碱分子量之比。
回收率试验:已知乌头碱浓度的参附注射液的制备:精密称取乌头碱标准品一定量,加入人参注射液使溶解,移入100ml容量瓶中,加入人参注射液至刻度,摇匀,备用。测定:分别精密量取已知浓度的参附注射液10.0ml,加氨试液调至pH10～11,用氯仿萃取,收集氯仿液,按上法制成供试品液10.0ml。然后,分别精密量取供试品液2.0ml,依法测定。以加入量与测得值计算参附注射中乌头碱回收率为97.78±1.01%(n=12)。加样回收试验:取已测定乌头类生物碱含量的参附注射液(811201),精密量取10ml,加入乌头碱标准品一定量,摇匀,加氨水调至pH10～11,用氯仿萃取后,同前法制成供试液10ml。精密量取供试液1.0ml,依法测定,测得值减去注射液中乌头类生物碱含量,与加入量计算回收率。实验结果:参附注射液中乌头碱加样试验回收率为95.68±1.84%(n=9)。
不同批号注射液中乌头类生物碱的含量测定:按上法经氯仿萃取分离后,用离子对萃取-分光光度法测定。结果如表12-1-3。
张兆旺等进行剂改研究,依据SBE法理论,以人参二醇、人参三醇、总生物碱、酯型生物碱、总糖和干浸膏为指标,用均匀设计法优选其SBE法工艺条件。
确定考察因素与水平:根据SBE法及附子炮制原理,在药材粒度、煎提温度、煎煮加水量、滤过、浓缩等条件相同的提下,确定考察主要因素及水平。
选用均匀设计表安排实验:U9(91×33)表安排各因素水平进行实验,实验方案见表12-1-4。
人参二醇、人参三醇的含量测定:供试液的制备:精取上述提取液50ml,浓缩至约35ml,加乙醇12.5ml和浓硫酸2.5ml,水浴回流4h,加水稀释至70ml,精取50ml,用适量氯化钠饱和,乙醚萃取5次(20,20,20,15,10ml),合并萃取液,用0.125mol·L-1的氢氧化钠溶液(50,30ml)洗涤乙醚液2次,再用少量水洗涤乙醚液至中性,用无水硫酸钠脱水,滤过,回收乙醚至干,残留物用氯仿溶解并定容至2ml,即得(每1ml相当于原药材1.75g)。对照液的制备:精密称取人参二醇1.4mg,人参三醇1.2mg,分别用氯仿定容至2ml,即得。标准曲线的制备:薄层扫描条件:人参二醇λS 535 nm,λR700nm;人参三醇λS530nm,λR700nm,灵敏度:中;SX=3;狭缝1.20mm×1.20mm;双波长反射式锯齿形扫描。标准曲线的制备:在0.3% CMCNa-硅胶C薄层板上分别点人参二醇对照液2.0,4.0,8.0,12.0,16.0,20.0μl;人参三醇对照液2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0μl,用氯仿-乙醚(1:1)展开15cm,挥干溶剂,喷10%硫酸乙醇,80℃烘10min,显色,扫描。以点样量为横坐标,峰面积为纵坐标作图,二者均得一不过原点的直线。人参二醇线性范围1.4～14.0μg,回归方程为Y=1775.0655X-9 57.1459,r=0.9987(n=6);人参三醇线性范围1.2～7.2μg,回归方程为Y=2444.4542X-1756.0173,r=0.9973(n=6)。供试液的含量测定:精取上述供试液24.0μl,人参二醇对照液4.0,6.0μl,人参三醇对照液4.0,12.0μl分别点于同一块薄层板上,按上法展开,显色,扫描,结果见表12-1-5。
总生物碱的含量测定结果见表12-1-5。
酯型生物碱的含量测定:对照液的制备:精密称取乌头碱对照品9.8mg,置10ml容量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度。标准曲线,以乌头碱含量为横坐标,吸收度为纵坐标作图,得一不过原点的直线,乌头碱线性范围0.245～2.450mg,回归方程为Y=0.1100X-0.0073,r=0.9979(n=6)。含量测定结果见表12-1-5。
Y=(人参二醇+人参三醇+总生物碱一酯型生物碱)×6+总糖×4+干浸膏×3总糖的含量测定:供试液的制备:分别精取上述提取液2.0ml,加95%乙醇,使含醇量达85%,静置冷藏24h,过滤,取沉淀加适量水溶解,滤过,加水定容于250ml容量瓶中,即得。对照液与显色剂的配制:精密称取干燥至恒重的葡萄糖5.0mg,置50ml容量瓶中,加蒸馏水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得对照液。称取蒽酮0.12g,置100ml容量瓶中,加入95%硫酸溶解并稀释至刻度,冷却至室温,即得0.12%蒽酮显色试剂(临用现配)。标准曲线的制备:精取葡萄糖对照液0.20,0.40,0.60,0.80,1.00ml,分别置干燥具塞试管中,补加蒸馏水使成2.00ml,分别加入0.12%蒽酮试剂4.00ml,混匀,放至室温。以蒸馏水2.00ml,加蒽酮试剂4.00ml为随行空白,在625nm处测定吸收度。以葡萄糖含量为横坐标,吸收度为纵坐标作图,得一不过原点的直线,葡萄糖线性范围0.02～0.10mg,回归方程式为Y=7.35X-0.026,r=0.9992(n=5)。含量测定:结果见表12-1-5。
干浸膏得率的测定:精取提取液制备项下提取液50ml,置已烘干恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,于105℃烘至恒重,计算干浸膏得率,结果见表12-1-5。
实验结果的处理:综合人参二醇、人参三醇、总生物碱、酯型生物碱、总糖和干浸膏得率结果于表12-1-5。并将各个数据按公式进行标准化处理,为9次实验每种指标成分结果的平均值,S为其标准差。将表12-1-5中Y的数据输入计算机,用JYSYSJ的数据分析模块处理,经多元线性逐步回归统计处理,F检验未通过,改用二次多项式逐步回归得回归方程(选入、剔除阈值均为0.1):Y=421.6545+17.20905A-39.26281C-110.4891D-2.516703AA+3.944085DD+0.2897563AD+7.729469CD。r=0.9999811,S=2.797384E-02,F=3780.865
查F值表F表0.05(7.1)=236.8,F0.05(7.1)<F,所以F检验通过,回归方程有意义。再将方程在计算机上进行优化处理(Y的期望方向:大),得出优化结果。采用均匀设计法对参附汤SBE法工艺条件进行优选,根据GLP(good lattice point)法优选结果,结合生产实际,三煎用水pH值依次为3.50,7.00,8.00;煎煮时间依次为2、1、0.5h。
6.提取液树脂处理研究[5]
树脂预处理及其质控指标:通过对HP3、DA201、D160A、LD601等四种树脂可溶出性杂质分析,认为可将其分成水溶出性、醇溶出性两类物质予以处理。实验表明:树脂先用蒸馏水漂洗,可有效地除去水溶出性杂质,并用处理液的电导率、易氧化物作为控制指标;然后,用95%乙醇回流搅拌洗脱,对醇溶出性杂质洗脱能力较强,并以对处理液的水稀释、易氧化物、荧光和紫外吸收等项目作为控制精制程度。认为经预处理后的主要指标可达到《日本药典》的有关规定。树脂经处理后,用95%乙醇浸泡过夜,浸泡液按注射液制备工艺处理后获得的空白水溶液,测得其LD50>50 ml/kg,说明空白液毒性极小。大孔吸附树脂对人参皂苷的吸附和解吸:通过对人参皂苷的静态吸附速度和动态吸附容量的测定表明:其中以LD601树脂吸附速度最快,LD601、DA201型树脂动态吸附容量较大,二者对总提取液的人参皂苷吸附容量约为15mg/ml树脂。溶液pH值中性时其吸附皂苷能力最佳。同时,考察了不同浓度乙醇对人参皂苷的解吸回收率,结合薄层层析鉴别和引入树脂杂质的可能性,认为以选择55%、75%乙醇解吸,解吸回收率即能达到70%以上;解吸液中较完整的保留了人参总皂苷。
人参提取工艺:在人参提取物精制中经试验筛选,采用LD601型树脂吸附、水和20%乙醇洗涤吸附树脂,55%乙醇解吸。解吸后的人参提取物水溶液外观、色泽有较大改善,配液后,经适当处理,制品澄明度符合注射剂要求。
附片提取工艺:附片的主要有效成分为多种相似结构的二萜酯类生物碱,即乌头碱,乌头碱有剧毒,但经水解除去乙酰基,相应产物毒性大大降低;附片提取物如法处理还不能保证注射液的澄明度,故在原工艺基础上,增加了二次碱性醇沉,制品澄明度符合要求。
配液后的处理:人参、附片提取物配液前pH值均应调至pH7～8,且二者差异不宜太大,混合后,放置一定时间,滤除沉淀有利于澄明度改善,且有效成分含量不变,配合适量活性炭处理,可提高制品澄明度及稳定性。综上所述,用LD601型大孔吸附树脂精制人参提取液,总皂苷回收率较好;基本解决了注射液的澄明度问题,制品各项检查符合注射剂要求,具有明显的药理作用;且工艺简单,产品成本低。
7.其他
陈氏[6]通过观察参附注射液与葡萄糖注射液等常用输液配伍的外观、pH值及含量变化等指标,考查了参附液的配伍稳定性。结果表明,室温配伍后24h内各混合液均澄清,除碳酸氢钠外,其余混合液pH值稳定,含量基本无变化。
杨氏[7]将参附散制成口服液,并采用TLC法对人参、附子的成分进行色谱鉴别。
【药理研究】
1.对心血管系统的影响
1.1 对心肌细胞膜ATP酶活性的影响[8]
将动物断头处死后,迅速取出心脏0.6～0.8g,在冰浴的蒸发皿内剪碎后,置于冰浴组织匀浆器(自制)中。加入适量的试剂Ⅰ液,匀浆分2次进行,每次半分钟(2×30s,间隔1min)。立即通过2层纱布过滤,收集滤液。滤液在0～2℃下1000r/min离心20min。沉淀再加试剂Ⅰ液约10ml,不断搅拌洗涤,再以同样的条件离心分离1次,再取沉淀加约10ml试剂Ⅱ液混匀后,在2℃冰箱中放置44～48h。然后,再按上法离心分离沉淀。沉淀用试剂Ⅲ液洗涤2次,每次约10ml(离心条件同前),最后取沉淀悬浮在约10ml试剂Ⅳ液中,作为心肌细胞膜ATP酶液。
心肌细胞膜ATP酶活性是以每小时每毫克膜酶蛋白水解ATP所产生的无机磷(pi)微克分子量表示。即μMpi/mg·h-1。本实验加入试验药后酶活性受到抑制程度是以酶的相对活力和抑制百分率表示(酶的相对活力是加入试验药后酶活性与同批全酶活性之比的百分数;抑制率是以100%减去酶的相对活力)。考虑到不同个体的大鼠心肌膜ATP酶对药物的敏感性可能有差异,因而本实验采用了7只大鼠心脏所制备的心肌膜ATP酶进行实验。结果见表12-1-6,表12-1-7和表12-1-8。
表12-1-7结果说明:参附液对正常大鼠心肌膜ATP酶具有明显的抑制作用,抑制强度随浓度的增加而加强(P<0.01;p<0.01)。
结果表明:人参总皂苷、附子总碱混合液对心肌膜ATP酶虽有抑制作用,但抑制强度较参附液明显减弱(P<0.05;P<0.05)。提示参附注射液可能具有不同程度的正性肌力作用。
1.2 对心肌缺血的保护作用[9]
用麻醉狗心外膜电图标测法来估测心肌缺血程度和范围及参附的作用
方法:取体重12～25kg的健康杂种狗,雌雄不拘,戊巴比妥钠(30mg/kg)静注麻醉。打开胸腔暴露心脏,分离和结扎左冠状动脉前降支(LAD),并描记心外膜电图。选择10个标测点,第1～9点均位于或邻近LAD结扎点以下的分支所支配的区域(缺血区和边缘区),第10点作为非缺血区的正常对照点。描记LAD结扎前、结扎后即刻、3、5、10和15min各标测点的心外膜电图,LAD结扎15min后松解灌流1h,再进行第二次LAD的结扎。参附组与对照组试验顺序按随机法进行。参附注射液按0.2ml/kg静滴给药30min,而后开始结扎LAD,对照组给等体积等时间的生理盐水。实验以ST段抬高≥2mV或下降>1 mV为阳性点,进行各时刻ST段变化的总点数(NST↑↓)和总毫伏数(∑ST↑↓)的统计处理。以NST↑↓估测心肌缺血范围,以∑ST↑↓估测心肌缺血程度。
结果:给参附注射液后,可明显减少心肌缺血后5min以内ST段抬高(≥2mV)或降低(>1mV)的总点数NST↑↓和总毫伏数∑ST↑↓。而心肌缺血后10～15 min的NST↑↓和∑ST↑↓减少不甚明显,见表12-1-9。
给参附注射液后,可轻度降低血压和心率,因而使时间一张力指数明显降低。由给药前的152.4±37.4(±s)降至118.6±25.1,P<0.05。
1.3 对心肌梗死的影响
用重量法测定结扎大鼠左冠状动脉主干后的心肌梗死范围(IS)观察参附注射液对IS的影响
方法:选用230～320g雌性Wastar大鼠随机分为两组(参附组和生理盐水对照组)。在乙醚浅麻醉下,仰卧位从左侧第4～5肋间切开皮肤后,用弯头止血钳插入胸腔并撑开肋骨,左手姆指和食指压挤右胸及膈下方,迫使心脏跳出胸外。大多数情况下心包已被剥脱。以心表面静脉为标志,选用冠状动脉分布为均衡型和左优势型的鼠心。翻开左心耳,并在其下面与肺动脉圆锥之间(相当于左冠状动脉主干起始处2～3mm处)用00号丝线迅速结扎冠脉,并立即送还心脏,关胸前挤出胸腔内的气体。多数动物在关胸后施行几次人工呼吸,就可恢复自主呼吸。手术结束后立即腹腔注射药物(参附或生理盐水,3ml/(kg·次),每日2次),共给药4次。
术后2日,开胸取出心脏,剪去房室沟以上部分,立即放入冰箱冰冻。待结冰后用多片刀(切片间隔1.5 mm)切成7～8块心肌片,然后用1%T.T.C.(2,3,5-氯化三苯四唑)磷酸缓冲液在37℃水浴上染色5min,而后将未梗死心肌(红色)和已硬死心肌(白色)分别剪开并称重。计算梗死心肌占整个心室肌重量的百分比,以此标志IS,并观测参附对IS影响的程度。
结果13只大鼠,除对照组有1只在术后24h内死亡外,参附组无1只死亡。给药组与对照组的大鼠活动情况无明显差别,只是手术后参附组复苏较快。参附组的IS为34.9±3.2%(±s),而对照组的IS为40.5±4.9%(±s)。两组比较P<0.05,说明参附可明显缩小IS。以上可能是参附汤或参附注射液在临床上治疗急性心肌梗死所致的心衰或心源性休克有一定效果的机制之一[9]。
牟氏[10]实验证实参附汤对家兔实验性心肌缺血也有疗效。用参附液(每1 ml含相当人参和附子各1 g)35mg、50mg、70mg/kg体重,均能显著对抗垂体后叶素引起大鼠急性心肌缺血的心电图ST段下移,其中以35mg/kg的效果最明显。在给药前,各组大鼠心律失常的发生率均在70%以上,且持续时间长而严重。给药后,发生率显著下降为25%,且表现轻而持续时间短[11]。
1.4 对心肌力学的影响
用人参注射液、附子注射液及参附液测定麻醉犬的Vpm、LVSP(左室内压峰值)、HR(心率)、P-R间期等指标,有改善心肌力学作用[12]。戊巴比妥钠引起急性心衰的豚鼠,静脉给参附液每分钟1ml/kg,每1ml相当人参、附子生药各0.5g。1min后,左心室压升高117%,其上升最高速率增加347%。3min后,平均动脉压升高90%,其中4只出现T波倒置或(及)J点提高,给药后有3只转为正常。对于离体大鼠乏氧所致心衰的参附液可使发生时间后移,心缩幅度增加44.4%。且参附液较单味(人参或附子)有更明显的效果,说明两药之间有协同作用[13]。
1.5 对冠脉流量及血管灌注量的影响
本药具有增加冠脉血流量及血管灌注量的作用。离体兔心灌流实验表明,给予本药后,冠脉流量即刻增加54.7±7.9%(P<0.001)。兔耳增加流量9.7±1.5%。人参即刻增加冠脉流量36%,附子即刻增加21%,说明单味药作用较配伍运用效果差。还能增加大鼠后肢血灌流量10.2±5.2%,作用维持10min以上[12]。对正常离体大鼠心脏冠脉血流量本药可增加24%附子增加11%。对于乏氧致衰的心脏可使冠脉血流量增加14.3±2.6%(P<0.01)。心率减少8.3±2.6%(P<0.05),使心衰发生时间后移,心收缩幅度增加44.4±11.2%(P<0.05) [13]。
离体兔心灌流实验表明,以0.03ml/30s给药后,冠脉流量即刻明显增加,心率略有减少,心缩幅度在即刻略为减小后10min内增加8.0±5.3%。与人参注射液、附子注射液相比,增加冠流作用最为明显且持续时间亦较长。以0.02ml/30s注射给药进行离体兔耳灌流实验,参附液增加流量9.7%,人参注射液增加7.9%,附子注射液仅增加2.3%。大鼠后肢灌流实验也证实,给予参附液后流量增加10.2%,人参注射液增加9.7%;附子注射液增加4.7%[14]。
1.6 对心肌细胞电生理特性的影响
用16只在体兔心室肌细胞和11份离体心肌组织灌流,静脉注射2ml参附液(每1ml相当于红参0.1g,附片0.2g)或灌流液中加入5%参附液,心率、APH、APD100、APD50均无明显影响;但能增加动作电位0相最大去极化速率,在体法由给药前的335±60V/S增加到403±70V/S;离体法由给药前的435±34V/S增加到513±27V/S。给药后有效不应期延长为125±9ms[15]。
1.7 对哇巴因心脏毒性作用的影响[16]
1.7.1 在体麻醉豚鼠试验
选用体重300～350g豚鼠,雌雄兼用,乌拉坦麻醉后恒速静注哇巴因(9μg/min,并监测Ⅱ导联心电图。将动物随机分为两组,哇巴因对照组(n=7):静脉注射生理盐水2ml/kg后恒速静注哇巴因直至死亡。参附注射液组(n=7):静注参附注射液2ml/(kg·30s)后再给哇巴因直至死亡。各组分别记录开始出现室性早搏(VEB),室性心动过速(VT),心室颤动(VF)和死亡时的哇巴因用量。两组比较,t检验法进行显著性检验。
静注哇巴因(μg/kg)269.7±21.5时出现VEB,327.7±16.7时出现VT,380.2±12.5时出现VF,419.7±19.4时死亡。预先静注参附注射液〔2ml/(kg·30s)〕可使哇巴因致VEB、VT、VF和死亡时的用量分别增至316.8±16.6(P<0.01),371.8±27.9(P<0.01),420.9±39.2(P<0.05),456.9±37.9(P<0.05)。
1.7.2 离体豚鼠心脏灌流
豚鼠体重250～300g,雌雄兼用。按照Langendoff氏方法制备离体灌流心脏。Krebs-Henseleit氏灌流液用95%O2和5%CO2饱和,pH7.4,温度34℃。在近房室结处置一电极,应用DCQ2型电子刺激器起搏,将心率控制在180次/min。心尖处剪一洞并给予2g的静息张力。心尖连接一拉力换能器,连续观察心脏等容收缩力及静息张力的变化。实验分为:对照组(n=5);哇巴因组(n=7),Krebs氏液灌流20min后换哇巴因(1μm)灌流液;参附注射液十哇巴因组(n=7),Krebs氏液灌流20min后换参附注射液(终浓度1%)十哇巴因(1μm)混合灌流液,各组均记录心脏收缩幅度及静息张力的变化,并与哇巴因组比较,用t检验进行显著性检验。
灌流哇巴因(1μm)20min后心脏收缩幅度显著降低,参附注射液(终浓度1%)加1μm哇巴因灌流时明显推迟心脏收缩幅度降低出现的时间,并可减轻心肌收缩力降低的程度(P<0.01);1μm哇巴因灌流心脏10min后到40min可明显升高心肌静息张力,参附注射液加1μm哇巴因灌流时,心肌静息张力的升高明显低于哇巴因组(P<0.01);收缩幅度降低50%的时间和静息张力升高50%时的时间均推迟了15min。
1.7.3 对心肌Na+,K+-ATP酶活性的影响
豚鼠心肌Na+,K+-ATP酶活性按照Hendle氏方法测定,其活性以μm pi/mg prothttps://www.shigongxiao.com/zhongyao/duiyao/h表示。1μm哇巴因几乎完全抑制豚鼠心肌Na+,K+-ATP酶活性,而参附注射液(终浓度1%)对该酶活性没有影响。
哇巴因对豚鼠心脏可诱发VEB、VT、VF等心律失常,参附注射液可明显提高哇巴因致各种心律失常和死亡时的用量;哇巴因(1μm)引起短阵的正性肌力反应后继之以收缩力持续性降低,静息张力逐渐升高。参附注射液可明显减轻上述毒性反应。心肌缺血、缺氧等是造成洋地黄中毒的主要易患因素。参附注射液有扩张冠脉,增加心肌血流量,降低心肌细胞耗氧量,保护缺血心肌,缩小心肌梗死范围等作用。鉴于该注射液对心肌的上述有益作用,又可保护性的减缓哇巴因引起的心脏毒性反应,故认为参附注射液在临床上如用于预防和治疗洋地黄类药物中毒可能有一定效果[16]。
1.8 抗心律失常作用
参附液(每1ml含相当红参和黑附片生药各1g)对乌头碱致大鼠室性或室上性心律失常、传导阻滞、室性心律等的有效率可达87.5%,与生理盐水组比较,差异显著;而附子注射液为75.0%,人参注射液约9.0%。实验中参附液有时很小剂量也能对抗室性或室上性心律失常,使心率明显减慢,说明本药液可能具有降低异位节律点,改善传导性能、改善房室间及心室的传导等作用[14]。随参附液用量的增加,氯仿所致小鼠室颤率呈下降趋势,与对照组比较,差异显著[13]。
2.抗休克作用
孙氏等为了进一步探讨参附青注射液(人参、附子、加青皮)抗内毒素休克机制,采用大肠杆菌内毒素复制大鼠休克病理模型,观察参附青对大鼠内毒素血症血浆前列环素(PGI2)、血栓素A2(TXA2)的稳定代谢产物6-keto-PGF1a、TXB2以及cAMP、cGMP的影响。
方法:50只大鼠随机分成5组、每组10只动物,麻醉后手术分离颈外静脉、颈动脉待用。正常对照组:动物麻醉后,经1.5h后处死取血。不注射任何药物,作为正常对照。预防组:又分为参附青预防组:动物先从颈外静脉滴注参附青3ml,于1h滴完。然后注入大肠杆菌内毒素4mg/kg(体重)。30min后处死动物取血。生理盐水预防对照组:先从颈外静脉滴注3ml生理盐水,其他与正常对照组相同。治疗组:也分为参附青治疗组:先注入大肠杆菌内毒素,10min后滴注参附青3ml于1h内滴完,处死动物取血。生理盐水治疗对照组:动物注入内毒素后10min,滴注等量生理盐水,其他步骤同参附青治疗组。
用硅化针筒试管取大量颈动脉血2ml。以3000r离心20min取血浆。按RIA方法,在LKBr计数器上测出各管的放射性强度(CPM),按回归方程:y=a+b·logx计算出TXB2、6-Keto-PGF1 α、cAMP、cGMP的浓度。结果见表12-1-10,表12-1-11,表12-1-12。
表2-1-10结果显示:正常大鼠血浆6-Keto-PGF1α含量为89.6±8.9pg/ml,而TXB2为792.7±70.1pg/ml,TXB2/6-Keto-PGF1a比值为10.5±2.0。大鼠经参附青预防滴注后注射内毒素,可使6-Keto-PGF1α和TXB2含量基本稳定在正常水平。生理盐水预防对照组TXB2含量明显升高(P<0.05),6-Keto-PGF1α显著下降,TXB2/6-Keto-PGF1α比值增大(P<0.01)。
表12-1-11显示:用参附青治疗大鼠内毒素血症可显著升高血浆6-Keto-PGF1a含量,与生理盐水治疗对照组比较,差别极为显著(P<0.01)。但对TXB2作用稍差,两组之间无显著差别。参附青治疗组的TXB2/6-Keto-PGF1α比值显著小于对照生理盐水治疗组,差别有极显著意义(P<0.01)。
表12-1-12证明:大鼠内毒素血症血浆cAMP含量比正常动物明显降低,应用参附青防治,其血浆cAMP含量都明显上升,与生理盐水对照组相比,差别极为显著(P<0.01)。但对cGMP影响不大,无论与正常大鼠或生理盐水对照组相比,差别均无统计学意义。
本实验提示:大鼠注射内毒素可以引起血浆PGI2-TXA2平衡失调(TXA2升高,PGI2降低)。如用参附青预先滴注,可保持正常范围内的动态平衡。用参附青治疗大鼠内毒素血症,则可非常显著地提高血浆PGI2含量,同时抑制TXA2的升高。
大鼠内毒素血症早期,用生理盐水防治,血浆6-Keto-PGF1α均降低,需经参附青预防或治疗后,才会升高。与一些文献报道注射内毒素后PGI2升高结果不同,需要进一步探索。于大鼠注射内毒素后,不仅明显降低血浆PGI2的含量,在与血浆环核苷酸同步观察中还发现,环腺苷酸(cAMP)含量亦降低。这些变化,用参附青防治,可同时提高PGI2、cAMP水平。参附青对内毒素血症大鼠血管内皮细胞有明显保护作用。血管内皮细胞是机体产生PGI2的主要场所。内皮细胞受到保护、再生增加,这就加强了机体的自我保护能力。
对于股动脉放血后失血性休克的家兔,使血压降至5.33kPa,静滴给药后,可使血压回升。回升达最高值所需时间为33±10.2min,平均维持时间为29.2±6.2min。而对照组血压虽有升高,但很快就下降,平均维持时间为16.7±3.6min。本方能显著降低休克动物乳酸和血浆组织蛋白酶活性(PCA)水平。若以休克20min时的乳酸和PCA水平为100%,给予本药3h后,乳酸含量下降为87.5%,而对照组却上升为133.8%,PCA下降为73.2%,对照组上升为24.4%。给药后血乳酸和PCA下降水平与对照组比较,差异显著(P<0.05)。乳酸和PCA水平随着动物休克时间延长而升高,死亡也随之增加。而本药能明显降低休克动物乳酸和PCA水平,比对照组显著延长[18]。实验发现,用参附代血浆给狗进行换血,在不回输自家血的条件下,当换血至500～1000ml时,对照组中用6%羟乙基淀粉组实验狗的血压下降8 kPa,低分子右旋糖酐组下降7.2kPa,而用参附代血浆组仅下降4.8 kPa。当换血至细胞比积在10%以下时,本方药组狗的死亡率为40%,6%羟乙基淀粉组为75%,低分子右旋糖酐组为100%。另本方药组PaO2较羟乙基淀粉对照组显著升高[19]。对家兔失血性休克实验中,本药组静注药后,血压平稳上升,脉压差,呼吸均得以改善,升压维持时间达3h以上。另参附柴液能提高感染性休克犬存活率,抑制DIC发展和稳定细胞膜。将麻醉犬舌静脉注射O111B4型活大肠杆菌5×109个/kg,造成感染性休克合并DIC。在注射菌液前0.5h,注射菌液后3、6h,西药组静脉注射地塞米松150mg/kg,中药组静脉注射参附柴液1ml/kg(每毫升含红参200mg,熟附子50mg,北柴胡80mg)。在注射菌液后3、6h两组皆静脉注射庆大毒素,盐水对照组注射等量生理盐水。结果与盐水组比较,中、西药组动物存活率显著提高(P<0.05,<0.01)。平均动脉压、血浆纤维蛋白原降低较慢(P<0.05,<0.01)。β-葡萄糖醛酸酶、抗凝血酶Ⅲ活性改变较小(P<0.05～0.01)[20]。夏氏等[21]报道了生脉、参附注射液对家兔休克复苏时血流动力学的对比研究。
3.对其他脏器缺血损伤的保护作用
3.1 对脊髓缺血损伤的保护作用[22]
18只雄性新西兰家兔,随机分为3组,保护组、治疗组、对照组。保护组和治疗组分别于缺血前30min内或再灌注30 min内持续恒速静脉输入参附注射液10 ml/kg;采用肾下主动脉阻断法造成脊髓缺血(20min);术后观察神经功能变化并记录1、4、8、12、24和48h神经功能评分,48h处死动物后取脊髓(L5～7)标本进行病理观察。结果:术后神经功能评分各时间点保护组和治疗组均明显多于对照组(P<0.05),保护组和治疗组间则无差异;再灌注48h脊髓前角正常运动神经元计数,保护组和治疗组均高于对照组(P<0.05),保护组、治疗组间无差异。实验显示参附注射液对脊髓缺血性损伤有明显的保护和治疗作用。
3.2 对肾缺血的保护
戴氏等[23]观察了参附注射液对肾缺血再灌注模型超氧化物歧化酶(SOD)及组织形态的影响。结果显示与缺血再灌注组相比,参附液组肾外髓水肿明显减轻(P<0.01),SOD活性明显增高(P<0.01),提示保护SOD活性,降低脂质过氧反应的作用是参附抗休克的机制之一。
阻断麻醉兔双侧血管造成肾缺血,然后再灌注。于缺血前及灌注后静注30%参附液3.0ml/kg体重。结果肾缺血的第1、3、5、7d参附组尿素氮(BUN)和Bcr值的升高明显低于对照组,Bcr的恢复也较其为快。提示参附组肾功能损伤程度较轻,恢复速度较快,肾组织形态学改变亦较对照组为轻,说明对兔肾缺血有保护作用[24]。与参附液有防治甘油引起的大鼠ATN的作用相一致[25]。
3.3 对缺血多脏器损伤的保护作用
家兔18只,采用失血性休克模型,随机分为3组,检测多脏器组织中SOD、MDA、TNF含量及血浆酸性磷酸酶(ACP)、镁浓度,小肠组织作透射电镜观察。结果再灌注90min后参附注射液治疗组肝、肾、肺、肠组织中的MDA和TNF水平低于对照组,SOD水平则高于对照组,血ACP、Mg2+浓度治疗组低于对照组。电镜观察,肠粘膜上皮细胞损伤参附组不明显[26]。
应用参附注射液和柴胡注射液在小鼠急性心肌缺血模型上观察小鼠血清中SOD活性的变化及心肌组织中丙二醛(MDA)含量变化。结果表明:缺血组与给药组相比,血清中SOD活性下降(P<0.05)。心肌组织中MDA含量增高(P<0.01)。提示两种制剂联合应用具有抗脂质过氧化作用[27]。
范氏等[28]实验观察了参附液和柴胡液体外对小鼠肝匀浆MDA和H2O2作用后兔血浆MDA、血浆游离血红蛋(PHb)的影响。结果两药都能明显抑制肝匀浆MDA的生成和H2O2引起的血浆MDA、PHb升高,随着药物剂量增加,抑制作用加强。两药合用抑制作用更强。说明两药有抗脂质过氧化作用。
刘氏等实验证明人参、附子、黄芪及其组方对大鼠肝匀浆过氧化脂质生成也有一定的影响[29]。
4.对血小板聚集及血液流变性的影响
本药具有显著的对抗ADP诱导血小板聚集作用。用药后15min开始起作用,持续10h以上,对血小板聚集的抑制率为:15min为33.7%,30min为33.8%,60min为37.3%,说明本药是一种起效快、持续时间长,作用较强的抗血小板聚集药[30]。给正常家兔静注本药100mg/kg后15、30、60min时,可使血细胞压积较给药前降低3.8%、4.9%、6.8%,全血比粘度降低8.7%、10.85%、15.4%,血浆比粘度降低3.8%、4.5%、5.7%,三者P<0.01。红细胞电泳时间给本药后显著加快。红细胞聚集率降低31.0%、30.5%、59.7%,均有非常显著差异。同时对血浆总胆固醇,由给药前40.8±1.54降到13.52±0.31mg%(P<0.01),三酰甘油由62.61±3.33降至46.29±2.64mg%(P<0.01),纤维蛋白原由147±1.3降至103±1.8mg%(P<0.01)。其作用比等毒性的丹参注射液为强[31]。
5.对免疫功能的影响
称取人参30g,附子15g,先后加蒸馏水1000和500ml煮沸2、1.5h,合并两次药液,过滤,水浴蒸发至100ml。另按同法煎制1g/ml人参和1g/ml附子二种药液。
小鼠灌服给药,对照组给水,每次0.6ml,每日2次,连续7d。将小鼠颈椎脱臼处死,进行中药诱导的IL-2上清液、ConA活化的小鼠脾淋巴细胞制备,测定IL-2活性。结果见表12-1-13,表12-1-14。
从表12-1-13结果可见,人参组、附子组与参附汤组无论cpm或GI均显著高于对照组(P<0.005-0.001)。提示参附汤及其单味人参、附子三者均有显著促进小鼠脾淋巴细胞产生IL-2的作用。
表12-1-14结果表明人参组、附子组与参附汤组无论cpm或GI均显著或明显高于对照组水平,与对照组相比,有显著(P<0.05)或接近显著差异(P<0.2～0.1>0.05),提示参附汤及其单味中药人参与附子有显著或明显促进小鼠混合脾淋巴细胞产生IL-2的作用。该结果与表12-1-13相似。观察结果表明参附汤及其单味方药人参与附子均能显著刺激小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2,无论用cpm或GI表达,结果基本一致。故提示参附汤有通过刺激IL-2分泌参与机体免疫反应调控的作用[32]。参附汤以人参与附子配伍,二者药量为2:1,虽皆能刺激IL-2分泌,但未呈相加作用。附子含有毒性很强的双酯类生物碱,与人参配伍亦未见拮抗作用。提示该方剂组成的科学性与药量的合理性。
参附汤的100%煎剂和水煎醇提液对淋巴细胞转化率为28.31%和48.62%。在活性花斑试验中,花斑形成率分别为61%和47%,均高于对照组[33]。说明本药具有增强细胞免疫的作用。体外实验表明,参附汤除能明显提高淋巴细胞转化率,促进活性花斑形成率外,并能抑制白细胞游走及促进产生溶血空斑。表明本药能够刺激细胞免疫及抗体生成反应[34]。
6.对糖皮质激素受体(GcR)的保护作用[35]
药物制备:参附汤由人参、附子(3:1)组成。失血性休克模型:在氯胺酮麻醉下,沿大鼠正中线剪开颈部皮肤及皮下组织,钝性分离颈前肌群至气管,在气管左侧找到颈动脉,远端结扎,近心端上动脉夹,剪一小口,插管,妥善固定。移去动脉夹放血。放血量为总血量的20%,均在1min内放完。
给药方法:模拟参附汤的临床给药方式,失血性休克大鼠分别于放血前30min、放血后4、8h及动物处死前30min由胃管注入参附汤1ml;对照组均灌以等量的生理盐水。
动物处死:为避免昼夜节律对激素分泌及其受体的影响,各组动物按预先设置的实验程序完成后,均在固定时间快速断头处死,以免动物挣扎,取所需组织测定。大鼠血浆糖皮质激素(Gc)和肝胞液GcR结合活性影响,见表12-1-15。失血性休克大鼠血浆皮质酮含量明显高于相应正常对照组,肝胞液GcR水平则明显低于正常对照组。参附汤对相应模型运动血浆皮质酮的异常增高,无下调作用,但对肝胞液GcR水平有明显的上升作用,实验中用药组大鼠肝胞液GcR水平的下降幅度低于单纯模型组,且差异有统计学意义。
研究结果提示参附汤使失血性休克大鼠肝胞液急剧下降的GcR水平明显升高。在应激时,血浆Gc升高通过对GcR的下调作用(Down-regulation)可使GcR减少,相反地,当血浆Gc下降时,它可使GcR增加。而参附汤组大鼠血浆皮质酮水平不仅没有下降,反而略有上升趋势。可见它们不是通过Down-regulation的途径来提高GcR的。
7.对甲状腺功能减退症大鼠的病理形态学的影响[36]
取Wistar大鼠18只,体重为100～140g。按性别、体重、体温和耗氧量基本均衡的要求,将动物分为3组:对照5只(雌2、雄3),肾阳虚6只(雌雄各半),治疗组(肾阳虚治疗)7只(雌4,雄3)。在同一条件下饲养,对照组饮用自来水;肾阳虚及治疗组饮用0.04%他巴唑水,68d后对3组进行体重、体温、耗氧测定后,治疗组每只大鼠以1mg/(100g·d)的剂量灌服参附汤1次(1ml含生药红参0.4g,黑附子0.3g),连续15d,与前2组同时测量体重、体温和耗氧量后,分批分期处死,立即剖解,进行外观检查,并切取各器官组织块,置10%中性甲醛固定,石蜡包埋、切片,苏木素—伊红染色,光镜观察。
正常对照大鼠被毛紧贴皮肤,密有光泽;眼睛明亮,粉红色;鼻唇洁净湿润,淡红;尾巴粗圆色粉红,腰背平直而活泼。肾阳虚大鼠被毛蓬竖,精神萎靡、团缩,食量减少,嗜睡少动,身材矮小,治疗组大鼠嗜睡少动,团缩等现象不太明显,食量亦较肾阳虚组为大。
表12-1-16显示,肾阳虚与治疗组大鼠体重下降,两组间无明显差异,体温肾阳虚组较低,但3组间无明显差异。耗氧量以肾阳虚组最低,与治疗组对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。
解剖所见,肾阳虚和参附汤组大鼠,各器官体积缩小,重量减轻,胸腺萎缩;肾阳虚组心脏处于舒张状态,呈球形扩大;参附汤组为收缩状态,扩大不明显。甲状腺占体重重量的百分比,对照组为0.02±0.009g,肾阳虚组为0.07±0.003g,参附汤组为0.06±0.008g,后两组与前组对比,差异皆有高度显著性(P<0.001,P<0.01)。肾上腺占体重重量的百分比,对照组为0.02±0.002g,肾阳虚为0.04±0.002g,参附汤组为0.07±0.01g,后两组与前组比较,差异均有高度显著性(P<0.01);后两组之间比较,其差异亦有显著性(P<0.05)。
组织学观察
甲状腺:肾阳虚、参附汤组大鼠,组织呈弥漫增生,滤泡变小,泡腔内类胶质极度稀薄或消失;上皮为高柱状,部分增生突进腔内形成乳头体;间质变小,血管扩张充血,对照组大鼠腺体滤泡上皮为立方状或扁平状;泡腔内充满类胶质,边缘整齐。
从表12-1-17看出,滤泡大小的平均直径及上皮厚度,肾阳虚、参附汤参附汤组与对照组比较,其间的差异皆有高度显著性(P<0.01)。肾阳虚与参附汤组在滤泡上皮厚度间差异亦呈高度显著性(P<0.01)。
肾上腺:对照组大鼠肾上腺皮质各带分界清晰;参附汤组各带分界模糊,束状带细胞增大,类脂质增加;肾阳虚与对照组比较,有明显差异。
睾丸:曲细精管的平均直径,对照组为0.134mm;肾阳虚组为0.102mm;参附汤组为0.106mm。肾阳虚组曲细精管各层生精细胞明显减少,精子瘦小而细长,数量减少;甚至上皮细胞变性、萎缩,胞浆呈网状,精子缺如;间质细胞萎缩变小,间质水肿。参附汤组与肾阳虚组比较,曲细精管各层生精细胞及精子数量均有增加。
卵巢:肾阳虚及参附汤组与对照组比较,卵巢体积缩小,各期卵泡数目减少。参附汤组卵泡数目较肾阳虚组有所增加,尚能见到发育较为正常的生长卵泡。
脑垂体:肾阳虚与对照组比较,前者垂体前叶兼色细胞明显增多,细胞增大,胞浆内见有大小不等的空泡,间质血管扩张充血。参附汤组与肾阳虚组相比,前者兼色细胞的数量及病变程度均有改善。
心脏:肾阳虚组大鼠的主要病理变化为:心肌纤维呈灶状纹理消失,肌细胞肿胀,见有空泡变及点、灶状坏死;间质有少量炎细胞浸润;部分病例见心内膜有间质纤维化。这些变化在参附汤组中均有明显减轻。
肺:三组大鼠均患有不同程度的间质性肺炎,各组间无明显差异。
肝:肾阳虚组大鼠肝细胞多肿胀、增大,胞浆疏松透亮呈空泡状,肝窦狭窄,参附汤组与之比较病变程度较轻。
胸腺:肾阳虚组大鼠胸腺小叶的皮髓质分界不清,皮质内淋巴细胞数量减少,网织细胞增生,部分呈梭形,并见有少量多核巨细胞;髓质内胸腺小体相对增多,多变性;小叶内及叶间纤维组织增生,并有单核细胞,嗜酸性和中性粒细胞浸润。参附汤组与之相比,胸腺小叶皮质部淋巴细胞数量明显增多,髓质内炎症细胞浸润与胸腺小体变性的程度也较轻。
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