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第节　中药鉴定的方法(第节　中药鉴定知识的起源与本草)

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本文导读目录：

1、第节　中药鉴定的方法

2、第节　中药鉴定知识的起源与本草

3、第节　概述

4、笾箕柴

第节　中药鉴定的方法 ♂

第节　中药鉴定的方法第4节　中药鉴定的方法 : 中药的鉴定方法主要有基原(来源)鉴定法、性状鉴定法、显微鉴定法、理化鉴定法、生物鉴定法,简称为“五大鉴定法”。上述的中药鉴定方法各有其特点及主要适应对象,既可独立使用,又能互相配合。各种方法的采取,因鉴定对象和目的而异。中药材与中成药的鉴定方法基本相同,但由于药材及其饮片主要作为原料,并具有特殊性,所以重点叙述。本节旨在阐述中药鉴定的一般技术及方法,并尽可能地反映出当代中药鉴定的技术水平。

一、基原鉴定法

基原鉴定(origin identification)法,又称来源鉴定法,它是中药鉴定的基础,也是中药研究、生产、开发利用的主要依据。基原鉴定法就是应用植物、动物或矿物形态和分类学等方面的知识,对中药的来源或原料药进行鉴定,确定其正确的学名(或矿物的名称)或中成药的原料组成,以保证在应用中品种准确的一种方法。来源鉴定法的特点是宏观,主要用于完整的植、动、矿物类药材的真伪鉴别。
以药材为例,如人参的来源是五加科植物人参Panaxg_inseng C. A. Mey.的干燥根及其加工品。在检品中,除原植物(原动物、原矿物)药用外,多数药材的药用部分为植(动)物的某一器官,或某一类器官的一部分,这些药用部分有较突出的外观性状特征可作为鉴定的依据,但大多数都要追究其来源才能确定该品种是否与药用来源相符合。
(一)鉴定的步骤与基本方法
以药用植物为例,一般通过以下步骤进行鉴定。
1.观察及描述
(1)观察的顺序及方法采用先观察整体、后观察局部形态的原则,通过观察要掌握检品形态上的共性和特性。观察时可借助放大镜进行。
(2)描述的方法描述时要准确使用植物形态学知识及专业术语,要按上述观察的顺序依次描述,并要详细记录。通过认真的观察、解剖和描述之后,就能抓住检品的特殊本质,只有掌握了其具体特征后,方可进行下一步工作,以达到确定品种的目的。
在实际工作中,遇到的检品多是不齐全的,除了极个别的品种特征十分突出可以鉴别外,常须深入产地调查和采集实物,了解其名称(俗名或土名)、分布、生境、习性、用药习惯、采收加工等情况,否则就无法着手鉴定。
2. 查阅有关文献资料 通过对原植物形态的观察和描述,能初步确定科属的,可直接查阅有关植物分科分属的资料;若不能确定其科属,可查阅植物分科、分属的检索表。
对于某些未知品种,鉴定特征不全或缺少有关资料者,也可以根据产地、别名、化学成分、功能等为线索,直接查阅与中药鉴定、药用植物等相关的综合性书籍或图谱,将描述的特征与书籍中记载的内容相比较,并加以分析,提供基本方向。在多数情况下,采用上述方法,均能正确鉴定品种。
3.标本核对鉴定 为了避免参考书刊的不足或需进一步确证,可与中药标本室(馆)中收藏的已经确定学名的标本核对。在核对标本时,要注意同种植物在不同生长期的形态差异,必要时可参考更多一些标本,这样才能使鉴定的学名准确无误。在有条件的情况下,若能与模式标本(发表新种时所被描述的植物标本)核对,对正确的鉴定更为有利。中药原植物标本经鉴定学名后,必须将其药用部分(药用植物全株者除外)标明相同的学名,作为药材的对照品妥为保存,以供研究工作或性状对比鉴定之用。
4.标本的采集与制备 为了能准确地鉴定中药的来源,采集和制备标本也是重要的一个环节。通常用于原植物鉴定的标本类型主要有:蜡叶标本、液浸标本和干燥标本。将制好的标本根据分类学方法进行排列,作为科研、检验或生产等的对照品。并编写名录索引,以便查阅。
中药的原植物鉴定,除了使用经典形态学和分类学的知识外,还可采用现代染色体技术、细胞分类和分子生物学技术、化学分类方法、数学分析手段等进行。
(二)学名的鉴定
生物类药材基原鉴定的最终目的是明确所鉴定的供试品是哪一个“种”,写出正确的学名。对于植物药来说,学名的鉴定是根据植物的形态及分类特征(种在自然界中的位置)给予某一种植物的科学名称,鉴定学名时要持谨慎的科学态度,不可无根据地抄上一个学名,否则会导致鉴定结论的错误,从而给工作带来损失,甚至影响临床用药的安全性和有效性。下面就与学名相关的问题概述如下。
1. 种的分类地位 “种”是植物分类的基本单位,所谓同种植物,就是因为他们具有相同的形态及组织构造,相同的生理生态,相同的地理分布和遗传特性,起源于共同的祖先,并在进化过程中已形成了特定阶段的类群。如果种内有些个体的某些特征彼此又有显著不同的,常再分为次一等级,即“亚种”、“变种”或“变型”等。习惯上使用的“品种”一词,一般只用于栽培植物的分类上,现在实际是指植物分类上的“种”。下面以乌头药材的原植物为例,列出其在植物分类学上的隶属级次,以了解“种”在植物界中的位置。
如:
　　　　界:植物界(Regnum vegetabile)
　　　　　门:种子植物门(Spermatophyta)
　　　　　　亚门:被子植物亚门(Angiospermae)
　　　　　　　纲:双子叶植物纲(Dicotyledoneae)
　　　　　　　　目:毛茛目(Ranales)
　　　　　　　　　科:毛茛科(Ranunculaceae)
　　　　　　　　　　属:乌头属(Aconitum)
　　　　　　　　　　　种:乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)
2. 学名的意义 不同种的植物都应有不同的名称。由于植物界的种类繁多,名称混乱的现象经常发生,不利于科学研究及学术交流。为了使一种植物在世界范围内有一个统一的通用名称,国际植物学会规定了在植物命名上的统一科学名称,简称为“学名”,用拉丁文表示。国际上规定的命名规则,为“双名法”。双名法规定每种植物的学名由2个拉丁字组成,第一个为该种所在属的属名,常用名词,第一个字母大写;第二个字是种加词(种小词),常用形容词表示该种的主要特征或产地,亦有用名词所有格或同位语名词的,第一个字母用小写;双名后面可附有定名人的姓氏或其缩写,构成一个完整的学名。例如:黄连的植物学名是Coptis chinensis Franch.,其中Coptis(黄连属)为黄连的属名;chinensis(中国的)是种加词;Franch. 系定名人A. R. Franchet的缩写。有时,在种以下还可以区分出亚种(亚种一般多用于动物)、变种或变型等。命名时,常常是在种名后面写上(也可不写)ssp.或var.或f. 等缩写字样,再加上亚种、变种或变型的拉丁名称及定名人姓氏,此为“三名法”(trinomial nomenclature)。例如鹿蹄草Pyrola rotundifolia L. subsp. chinensis H. Andres为亚种;短萼黄连Coptis chinensis Franch. var. brevisepala W. T. Wang et Hsiao为变种;怀庆地黄Rehmannia glutinosa Libosch. f. hueichingensis (Chao et Schih) Hsiao为变型。
3. 学名中几个常用拉丁字和词组(包括缩写)的意义
(1) et 表示有几个著者(定名人),在最后一个定名人前插入et。如天竺桂Cinnamomumjaponicum Sieb. et Zucc.,这表明此学名是由Siebold和Zuccarini二人共同确定。
(2) et al. (et alii) 用于2个以上著者,在第一位著者名后写出,表示省略其他著者姓名。如链霉菌Streptomyces alboniger Hesseltine et al.
(3) ex 这表明某一学名为一位著者所建议,但未作生效发表,而后来另一位著者作了生效发表,在其名后和正式发表者之前加ex连接。如唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.,这表明Maxim. 确定了这个学名,但他自己从未作生效发表,也许他把此学名写在标签上或写在手稿上;或虽发表了,但缺乏特征性的描述,根据国际植物命名法规,这个学名不能成为生效发表的学名。后来Balf. 同意用这个学名,并作了生效发表(即正式在刊物上发表,并附有特征性的描述),这表明Balf.对这个学名负有生效发表的责任。Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.也可以缩写成Rheum tanguticum Maxim. 的形式。
(4) in 一位著者将一植物名称及其描述发表在另一位著者的著作中,此二位著者用in连接。如Viburnum ternutum Rehder in Sargent Trees and Shrubs 2:37(1907),这表明Rehder将这个学名及其描述发表在Sargent的Trees and Shrubs 2 : 37(1907)文献之中。
(5) auct. non 其意为“某(些)著者(们)的,但并非……的”。如Corydalis bulbosa auct. nonDC.,这就是说过去某些著者所定的这个学名的植物与De Candolle所定的这个学名的植物并非是同一种。
(6) non…,nec… 即非(不是)……又非(不是)……,如Rubus asper auct. Jap. non Wall. necPresl,这表明这个学名曾由Wallich和Presl定过,实际上他们各人指的也是不同的植物,但日本学者所定的Rubus asper既不是Wallich所指的那一种,也不是Presl所指的那一种。
(7)部分拉丁术语缩写的含义 comb. nov. 即combinatio nova,新组合; fam. nov. 即familianova,新科;gen. nov. 即genus nova,新属;sp. nov. 即species nova,新种;var. nov.即varietasnova,新变种;f. nov. 即 forma nova,新变型;sp. 即species,种;spp. 即species (pl.),种(复数);ssp. 即subspecies,亚种;pl. 即planta,植物。

二、性状鉴定法

性状鉴定(macroscopical identification)法也叫“直观鉴定法”,是用感观来鉴定中药性状(characteristics)是否与规定的标准或对照品相符合的一种方法。它是由传统鉴别方法与现代生物学和矿物形态学方法相结合而形成的。具体地说,就是用眼看、手摸、鼻嗅、口尝、感试等十分简便的方法来鉴别中药的真伪、纯度或粗略估计品质的优劣。它包括看、量、嗅、尝、试5种主要的传统经验鉴别法,具有简便、易行、迅速的特点。本法适用于各类中药的鉴别,必要时可配合其他鉴定方法加以确证。性状鉴定的基本步骤和基原鉴定一样,除对供试品仔细观察并加以描述外,有时亦需进行核对标本和核对文献等工作。
性状鉴定法在中药鉴定中占有十分重要的地位,它是中药鉴定工作者必须掌握的基本功之一,也是行之有效的方法。现以药材及其饮片的性状鉴别为例说明如下:
(一)性状特征的描述方法
中药的性状是根据其原植(动、矿)物的入药部分经过加工和炮制后的性状而制定或描述的鉴别依据。药材的性状包括有形状(shape)、大小(size)、颜色、表面特征、质地(texture)、断面特征、气、味等内容,在进行鉴定工作时,通常需要依次观察和描述。对各项内容的描述一般采用两种方法进行:一是使用生物学或矿物学的形态、组织学等名词;二是采用广大医药工作者在长期实践中积累起来的生动、形象的经验鉴别术语。前一种描述方法,便于掌握药材鉴定的规律性,容易分类和推广,并可使带有地区性的经验鉴别术语能更准确和趋于统一;后一种方法语言简单,好记易懂,针对性强,但不易掌握其规律性。
(二)性状鉴定的内容
中药性状鉴定的内容各有特点,有时感知一种特点,便能达到对比鉴别的目的,其各自的描述方法也不一样,为了便于掌握,现将其主要内容及描述方法分述如下:
1. 形状 指中药的形状特征,一般较为固定,其与药用部位密切相关。如根类药材一般均呈圆柱形、圆锥形,其中部分块根呈纺锤形或不规则块状;根茎类药材的形状因来源不同而异,根状茎与根类同,块茎常呈长圆形或不规则形,球茎和鳞茎常呈球形、类球形或扁球形,鳞茎由鳞片构成且顶端常尖等;皮类药材呈卷筒形、凹槽形或扁片状等。有些药材可用简单的语言概括其外形特征,使之便于记忆。如海马为“马头蛇尾瓦楞身”,山参常为短横体或横灵体,味连呈鸡爪形等;有的则以形示物作为药材的名称,如酱瓜天麻、乌头、钩藤等。观察形状时,亦可用下列术语描述,如头(指根及根茎的上部)、芦(指根顶端短缩的根茎)、身(指根的主根)、梢(指根的下部或支根)、须(指小根或须根)、连珠(指根及根茎膨大部分呈连珠状)、疙瘩(指突起不规则)等。
一般药材的形状是不难描述的,常不需要预处理,但在观察皱缩的全草、叶或花类药材时,须先置温水中浸软,摊平后进行观察;观察某些果实、种子类药材时,亦可预先用热水浸软,以便剥去果皮或种皮,描述内部特征。
2. 大小 系指药材的大小、粗细、厚薄等,即对其进行测量。测量的工具一般用毫米刻度尺,单位多用“cm”,特殊的用“m”或“mm”。要得出比较正确的大小数值,应观察并测量较多的供试品。表示药材的大小,一般有一定的幅度,当所测药材的大小很不一致时,要注意测量几个最大的或最小的,取其最大值和最小值。对于某些细小的种子或果实类药材不便测量时,可将其放在印有毫米方格线的纸上(或坐标纸),每10个排成1行,测量其总长度,然后计算其平均值。较小的药材亦可在实体解剖镜或放大镜下测量。药典和有关文献中记载的药材大小,是指常见的大小,测量的大小与规定有出入时,应测量较多的供试品,允许少量药材的大小略高于或略低于规定的数值。
3.颜色 常指商品药材的色泽,一般较为固定。有些药材以颜色命名,极易识别,如黄芩、紫草等。药材的色泽可作为其质量的标志,如玄参要黑、茜草要红、黄连要黄。色泽的变化与药材的质量有关。某些药材由于品种不同、加工条件变化、贮藏时间的不同或杀虫不当等,就会改变其色泽。如绵马贯众久贮,根茎和叶柄基部断面变为棕黑色而不能药用;枸杞子和牛膝变黑后,就说明其已变质。药材颜色的观察与描述,应采用干燥的药材在白昼光下进行,才能得出比较准确的结论,必要时可用日光灯,但不得用其他灯光。药材的颜色,一般均为复合色调,描述的颜色应以后一种色调为主,前一种为辅助色调。如小茴香呈黄绿色,即以绿色为主,黄色为辅。如果所描述的药材具有2种不同的颜色,一般将常见的颜色写在前面,少见的颜色写在后面,用“或”连接,如王不留行呈黑色或棕红色(未成熟);若药材的颜色变化在一定的范围内时,可将2种颜色用“至”连接,如天冬的表面呈黄白色至黄棕色。
4.表面特征 指药材的表面(有的包括外表面和内表面、上表面和下表面,如皮、叶类药材)所能看到的特征。包括光滑、粗糙,有无皮孔、毛茸、鳞叶及其他附属物,有无纹、皱、槽、沟(均指表面皱纹的形状),有无节(包括细节、环节等)等。如人参根上部具横皱纹;川木香具纵槽,金银花花冠表面密被毛茸等。描述时,均需用未经处理的干燥药材进行观察,要特别注意药材不同部位的鉴别点。如防风的根头部具明显的密集环纹(习称“蚯蚓头”),其上有的具残存的棕褐色毛状叶基,根的中、下部有纵皱、横长皮孔及突起的细根痕。
5. 质地 是指用于折试药材所感知到的特征,一般用软硬、坚韧、疏松(或松泡)、黏性、粉性、致密、轻重、油润、绵性、角质、柴性等术语加以描述或形容。描述及折试时,需用未经处理的干燥药材,并要注意药用部位或加工方法不同的药材质地。如附子的加工品盐附子和黑顺片、白附片,前者质重而坚硬,后者质硬而脆且呈角质样。描述质地的各种术语,均有一定含义。“松泡”表示质轻而松,断面多裂隙,如南沙参;“粉性”表示含有一定量的淀粉,折断时常有粉尘散落,如山药;“黏性”表示有黏液质,如石斛嚼之则显黏性;“油润”表示其质地柔软,含油而润泽,如熟地黄;“角质”表示质地坚实,断面且呈半透明状或有光泽(常因含多量淀粉,蒸煮时致使糊化而成),如法半夏;“糟”表示枯朽,呈朽木状,如川木香;“柴性”表示纤维性强,木质成分较多,折之如柴,敲之作响,如桑白皮。描述时须用未经处理的干燥药材。
6. 断面特征 包括自然折断面和用刀横切(或削)的平面。
(1)折断面主要观察和描述折断时的现象,如折断的难易程度,折断时的声响,有无粉尘飞扬,新鲜的药材有无汁液流出等。折断后的断面,常呈下列特征:如平坦、纤维状、刺状、颗粒性、层状或呈胶丝状等。
(2)横切面注意观察和描述皮、木部的比例,以及色泽、射线与维管束的排列形状。常用的术语有:“菊花心”,指根或根茎的横切面的中心部位具有类似菊花瓣状的放射状纹理,如黄芪等;“车轮纹”指药材的断面纹理呈车辐状,如防己;“网纹”,指断面具网状花纹;“油点”或“朱砂点”,指具有红色或红棕色的油细胞或油室;“霜”或“毛”,指药材析出的结晶,如茅苍术;“星点”,指大黄髓部的异型复合维管束(compound vascular bundle);“云锦花纹”,指何首乌的花朵状纹理(异型复合维管束,存在于皮层),又称“云纹”;“金井玉栏”,指某些根类药材断面浅棕黄色的形成层环与类白色的皮部,如桔梗;有的木部具小孔(导管),如关木通等。断面特征主要用于鉴别易混药材的饮片。如土茯苓片片面淡棕色,有光滑感;萆薢片片面淡黄色,有弹性;姜黄片棕黄色,断面角质性,内有黄色环纹;片姜黄片面淡土黄色,片面无横纹而有筋脉纤维;青皮片皮薄,中空而虚;枳实片皮厚,中心充实。
7. 气 指药材具有特殊的气,是用嗅法识别药材。药材的气是由于含有挥发性物质的缘故,有些药材的气十分特殊,可作为鉴别的主要依据。有些药材以其气命名,便于识别,如麝香、败酱草等。嗅法鉴别药材,一般比较可靠,如阿魏具强烈的蒜样臭气;白鲜皮有似羊膻气;檀香具有其固有的特异芳香气等。对气的描述时,可直接嗅闻干燥的药材,无特殊气存在,可用气微、气无或无臭等词描述。如果某些药材气不强烈,或因干燥后不易嗅出时,可将样品砸碎、切断或揉搓后再嗅闻;或放在有盖的杯子里,用热水湿润或浸泡后再嗅,或用火烧后再嗅。如薄荷可揉搓,荆芥可哈热气,血竭可燃烧后嗅气等。
8.味 是用味觉来识别药材,又称尝法。有些药材以味取名,直接可以反映出药材各自味的特征,如苦参、甘草等。药材的味也是评价质量的标准之一,如乌梅以其味酸为佳;甘草、党参以味甜为佳;黄连、黄柏以味越苦越好;肉桂以味甜辣为佳。通过尝味,可感知一些药材的特征,如当归和独活饮片较难区分,尝其味则可鉴别,当归先苦辛而后微甜,独活先苦辛而后麻辣。此外,亦可用于鉴别某些药材是否符合炮制的要求,如半夏、乌头等。在描述时,对于无味者,可写味淡或不写。尝时要掌握舌各部位对味觉的敏感程度,一般地说,舌尖部只对甜味较敏感,舌根部对苦味较敏感,所以尝药味时,要取少量有代表性的样品,放在口里咀嚼至少1min,使舌的各部位都充分与药液接触,这样才能正确地尝到药味。此外,药材的各部位不同,味道可能不同,如皮部与木质部、内侧与外侧、果皮与种子等各部位的气味常有区别。对于叶类和全草类药材,最好是加少量水煮几分钟后,尝药液的味。对于有强烈作用或毒性的药材,口尝时要特别小心,取样不可太多,尝后一定要吐出来,并用水漱口,以免中毒,如草乌、半夏等。药典中未规定味感的药材,可不尝味。
9.水试 利用某些药材在水中产生各种特殊的变化来鉴别药材。如红花水浸泡后,水液变成金黄色,其花色不褪;苏木投入热水中,呈鲜艳的桃红色透明溶液;熊胆仁投入水中,可逐渐溶解而盘旋,并有黄线下垂至杯底而不扩散;小通草遇水显黏性等。这些用水试产生的现象与药材所含有的某种化学成分有关。采用水试法,亦可用于鉴别药材的优劣,水试所用的水一般指清水,描述时主要注意药材入水后所产生的现象。如沉浮、溶解与否、透明度、膨胀度、颜色变化、有无黏性、旋转与否等。
10.火试 是指用火烧、煅药材,观察所产生的现象,以鉴别药材。有些药材用火烧后,能产生特殊的臭气、颜色、烟雾、响声等现象,如降香用火烧之微有香气,点燃则香气浓烈并有油流出,烧完留有白灰;血竭粉末放在白纸上,下面用火烤即熔化,色泽鲜红如血,且透明无残渣;海金沙点燃可发出爆鸣声及闪光,可区别相似品松花粉及蒲黄;麝香少许用火烧之有轻微爆鸣声,起珠状油点,香气浓烈,无臭气,灰为白色。
药材性状鉴定的内容,除上述各项外,还可利用药材的某一突出特性进行鉴别。如用“磁石召铁”以鉴别含铁类药材;“琥珀拾芥”,即指琥珀经摩擦可产生静电引力,吸得芥子者真;牛黄“俗人多假作,鉴别时以清水湿润后涂于指甲上,指甲被染成黄色而不脱者为真”,习称“透甲”或“挂甲”;还有用器械敲击药材,听其声音判断药材优劣等方法。

三、显微鉴定法

显微鉴定 (microscopical identification)法就是利用显微镜(microscope)、显微技术(microscopy)及显微化学等方法对中药进行分析鉴定,以确定其真伪、纯度(purity)或品质。在鉴定过程中,以采用显微镜观察动、植物的组织构造、细胞形状、内含物的特征以及矿物的光学特性等为主要内容。显微鉴定是一项专门技术,需要有植物(动物)解剖学、矿物晶体光学、植物显微化学等基本知识,掌握显微制片等基本技术。显微鉴定的主要仪器有各类光学显微镜和电子显微镜等,通常使用光学显微镜。
(一)显微标本片的制备
在进行显微鉴定时,应首先选择具有代表性的检品,制作显微标本片,然后在显微镜下进行观察。显微标本片根据制作方法和保存的需要,分为半永久制片、永久制片和临时制片3大类。半永久制片的封藏介质是半固体,可作暂时性保存;永久制片的封藏介质是固体,可作长期保存,但其制作费时,多用于特殊目的,如供显微摄影和核对标本等应用;临时制片的封藏介质是流动性液体,容易损坏,不耐久藏,但制作简单、迅速,适用于一般观察及进行显微化学反应(microchemicalreaction),在中药鉴定工作中应用最多。在鉴定工作中,由于观察的目的不同,对不同检品采取的制片方法也不同,所以又分切片标本片(包括横切片、纵切片,纵切片又包括切向纵切片和径向纵切片)、解离组织标本片、表面标本片、粉末标本片和磨片等。其中横切片多用于观察组织的排列特征;纵切片多用于观察茎、木类中药的某些细胞组织,如射线的特征;解离组织片用于观察某些细胞的形状,如纤维、石细胞等;表面片多用于观察叶、花、全草、果实和种子等的表面特征,一般取某一部分制片;粉末片多用于观察组织碎片、细胞及后含物或某些中药颗粒的特征;磨片用于坚硬药材如骨类、贝壳类及矿石的显微特征观察。
(二)显微鉴定的主要内容
显微鉴定的目的多数用于品种鉴定,部分用于定量分析。按照鉴定的方法可分为组织鉴定、粉末鉴定、显微常数测定和显微定量等。组织鉴定是粉末鉴定的基础,以粉末鉴定应用最为广泛。
1. 组织鉴定 组织鉴定是通过观察生物药的组织构造特征来达到鉴定目的,主要用于个体较小的完整药材鉴别。通常用以鉴别药材性状特征不明显或外形相似而组织构造不同的类似品、混淆品、代用品、伪品,或用于多来源药材的对比鉴别,也可用于确定某种化学成分的存在部位,以考查质量。一般地说,组织鉴定对不同科属来源的药材鉴别比较容易,对于相同科属的药材鉴别比较困难。
2.粉末鉴定 主要是通过观察中药的细胞、内含物和颗粒物质的性状特征来达到鉴定的目的。通常用于粉末药材、外形较大或组织构造无鉴别特征的药材、破碎药材、粉末性的中成药。
3. 显微常数测定 常见的显微常数主要有用于植物的叶类中药鉴别的栅表细胞比、气孔数、气孔指数、脉岛数和脉端数等,这些显微数据常因中药原植物种类不同而异,常用于叶类药材、部分花类和带叶的全草类药材的定性鉴别。尤其是一些同属不同种来源的药材,当其他显微特征如毛茸、结晶等比较相似而难以鉴别时,这些显微数据的测定对于品种鉴定具有重要的意义。
4. 显微化学鉴定 在进行显微鉴定工作中,经常用显微化学反应来检查中药中细胞壁和细胞内含物的化学物质的性质来达到鉴定的目的。当药材的数量很少、其中的某些成分化学反应较灵敏时,可使用显微化学鉴定法。
(1)显微化学反应本法主要用于药材的临时切片(新鲜的材料效果尤佳)或粉末,主要进行细胞壁的鉴别:如木质化细胞壁、木栓化细胞壁、角质化细胞壁、纤维素细胞壁、半纤维素细胞壁、硅质化细胞壁、黏液化细胞壁、几丁质(壳多糖)细胞壁等;糖类的鉴别:如淀粉、菊糖、可溶性糖类、黏液质和果胶质类;蛋白质(糊粉粒)类的鉴别;鞣质类成分的鉴别;草酸盐的鉴别;碳酸盐的鉴别和生物碱等化学成分的鉴别等。
(2)显微定位就是用显微化学的方法确定药材中化学成分的存在部位(有效部位),以此鉴定药材的质量和品种。显微定位的应用必须在所鉴定的药材有效成分明确的情况下,然后选择对有效成分具有特殊反应的化学试剂,使之产生颜色或结晶,用显微镜确定有效成分的存在部位。具体方法是:取药材用水浸软或软化后,切成薄片,滴加特定的化学试剂,封片检查。本法是中药鉴别和质量评价(quality evaluation)的一种简单、有效的方法之一,但选择有专属性的化学试剂较为困难。
5. 显微定量 显微定量是利用显微镜及显微测量的某些手段,对一定重量单味药材粉末中的某些显微特征数量进行分析,或测定粉末性中成药中某个组分百分含量的一种方法。本法亦适用于粉末中药混存物的含量测定。显微定量分析主要用于解决采用理化方法难以控制中药质量的一些问题。如按规定药材丁香中丁香酚的含量不得少于11%,实际上其含量多数情况下均在11%以上,如果在丁香粉中掺入一定量的丁香梗粉,则掺杂后混合物的丁香酚含量用液相色谱法测定,仍可合乎规定的标准。在这种情况下,若采用显微定量方法来鉴定掺伪物的含量,一般均可收到满意的结果。
在进行中药的显微定量分析时,需定量的药材应呈细粉状态,被测目的物一般需具备下列条件:一是应轮廓清晰、可以计数的颗粒,颗粒应为下列3种类型之一,即粒状(为大小与形状比较均匀的、分开可以计数的颗粒,如淀粉粒、孢子、花粉粒)、线状(为粗细比较均匀的细长颗粒,其长度在一定的放大倍数下可被测出,如马钱子毛茸的毛肋)、片状(为1个细胞厚的层状组织,在一定的放大倍数下可被描绘下来,如叶类药材的表皮、某些种子类药材的石细胞层、单独存在的或成单细胞层存在的梭形纤维或不规则形的细胞等);二是应易于检识且遇常用的显微化学试剂和封藏剂不发生形态变化。此外,检品在测定前,要先进行显微检查,明确测定对象,根据不同的对象,然后按照不同的方法测定检品中所含特征性颗粒的数目、长度或面积等。显微定量的常用方法如下:
(1)定重量、定面积法该法是一种直接定量的方法。例如测定黄柏和苍术的混合粉末中二者的配合比例。应首先通过显微观察来确定二者的存在,然后选取具有代表性的特征物进行检测和计算。在这一混合粉末中,苍术不含淀粉粒而黄柏则含有淀粉粒,因此可以根据淀粉粒的多少来确定此混合粉末中黄柏的含量。基本方法是:将此混合粉末制成混悬液,取1滴在显微镜下检查,假如发现共有淀粉粒30个,再配制成含有10%黄柏的混合粉末,如上处理并检查,若发现有淀粉粒60个,即可证明混合粉末中含有黄柏粉末为5%。对粉末性中成药中各种组分的测定,亦可按下法进行:精密称定经过处理的供测定样品,定容成混悬液。精密吸取一定量的混悬液,数量可根据其是否能充满已知面积的盖玻片下方。选择具有代表性的目的物作为测定计数的特征。测定前先测出视野的面积,每片选取25个视野进行观察并记录特征总数。然后按下列公式即可计算出该混合粉末或中成药中某药材粉末的百分含量。

式中:N——25个视野中某特征物数量之和,A——盖玻片面积(mm²),V——供试品定容的混悬液体积(mL),A′——25个视野的总面积(mm²),V′——盖玻片下混悬液的体积(mL),W——供试品的重量(mg),P——纯净某药材每毫克的特征数。
定量分析所用的检品重量应以105℃干燥品计算。可测定6个显微制片取其平均值作为检测数据。每毫克纯净药材粉末中的某特征数(P)的测定方法同上,但应按下列公式计算:

上述显微定量方法简便,但由于实验条件难以保证完全相同,如药材的粉碎度、混悬液滴的大小、供试品含水量的高低等,均可导致液层的厚度改变以致影响测定结果的准确性。
(2)比率计数定量法这种方法是在被测粉末药材中加入一定比例的重量指示物质,这些重量指示物质应具有个体体积是一个定值、大小均匀(差异小)、流动性好、含水量稳定、一般不受酸、碱等化学试剂的影响。取重量指示物制成混悬溶液,取1滴混悬液放在载玻片上,加盖玻片后,置显微镜下计算若干视野中粉末药材的特征性颗粒数和指示物质的颗粒数,并求出二者的比率。由于指示物质每粒的重量是已知的,所以根据所用粉末药材的指示物质的重量以及计数所得的结果,就可以算出单位重量的粉末药材中所含特征性颗粒的数目。采用此种方法比定重量定面积法简便且快速,既不需要测定载玻片上液滴的重量,也不需要计算盖玻片和视野的面积。在中药鉴定工作中,最常用的指示物质是石松子,利用石松子(为石松科植物石松Lycopodium clavatum L.的成熟孢子)为重量指示物的比率计数定量法简称为“石松子法”。一般测定方法如下:例如,若测定黄柏与苍术混合粉末中黄柏的含量,可先测定每毫克黄柏粉末中所含淀粉粒的数目。即先称取一定量的黄柏粉末与一定量的石松孢子混合(假定1 : 1),然后加适宜的液体作成均匀的混悬液,取1滴放在载玻片上,加盖玻片,在镜下计算25个视野中的孢子数与淀粉粒数。
此外,还可根据粒状和线状特征物的总重量与其数目成正比的关系进行粒状或线状特征物的数目测定、用于评价矿物类中药的质量的组分含量测定法等。
(三)显微特征的观察与描述
中药的显微特征是通过观察其各种显微制片所得到的显微形象,对这些显微形象进行准确的描述是十分重要的。因此,显微特征的描述是显微鉴定工作中的重要内容,也是必备的基本功之一。
1. 一般描述方法
(1)组织排列的描述主要用于完整药材的各种制片的组织观察。在描述时,一般是由外向内依次进行。例如茎类中药中草质茎的组织排列,应该先描述表皮,然后依次描述皮层、中柱鞘、维管束(韧皮部,形成层,木质部)、射线与髓。在描述中除按常规要求注意其各部分的位置、形态、有无其他组织分布等特征外,还应该注意射线、形成层、栓内层和皮层的特征。
(2)细胞形状的描述常采用平面和立体2种方式进行,具体运用哪一种方式进行描述,可根据具体情况和工作需要加以选择。平面描述,就是根据1种显微制片上见到的细胞形状进行描述;立体描述,就是把显微制片上见到细胞3个切面(横切、径向纵切、切向纵切)的形状综合起来,描述其立体形状。平面描述比较简单易行,但不易使人得到立体的概念;而立体描述需要综合后才能写出,但其概念明确,最适用于粉末药材的观察。例如木栓细胞的平面描述:横切面观扁平而切向延长,纵切面观扁平而径向延长,表面观呈多角形;立体描述则是把上述3个切面见到的形状综合起来,描述其立体形状,即木栓细胞呈扁平多边形。
(3)大小和数量的描述有3种方式可在不同的情况下采用。①当目的物的大小或数量差异很小时,可记载1个数字,如直径约30μm。②当目的物的大小或数量有不很大的差距时,可记载2个数字,即最小值与最大值,如长为15～40μm;如有少数达50μm,则可记其长为15～40(50)μm。③若目的物的大小或数量有很大差距时,可记载3个数字,即最小值、常见值(不是平均值)和最大值,如长20～40～80μm。在大小和数量的描述上,允许有少量超出上下限范围的数值,但超出的数字一般不得超过±10%。
显微测量数据处理的一般原则:10μm以下可以带小数;10μm以上的则宜把小数4舍5入变为整数;200μm以上的数值,则可把个位数4舍5入变为十位数。这是因为中药的原植、动物体本身变异和显微测量的精确度影响,使10μm以上数字中的小数和200μm以上数字中的个位数变得没有实际意义的缘故。
(4)颜色的描述其描述的方法与性状鉴定中药材的颜色描述方法相同。
2.粉末显微特征的描述 粉末性中药的显微制片在镜下观察时,多种组织碎片、细胞或内容物等杂乱无章地呈现在眼前,不像组织构造那样层次分明。因此,在进行特征描述时,首先需决定描述这些显微特征的顺序,也就是说,先描述什么,后描述什么。一般可遵循3条原则:即“先多数后少数,先特殊后一般,先感观后测试”。这3条原则不论是对于单纯粉末、混合粉末、粉末性中成药的显微特征描述,都是适用的。
(1)先多数后少数粉末性中药镜检时,总是数量较多的容易被察见,数量较少的难于察见,有些特征极为稀少,所以在特征描述时应先描述多见的、易见的,后描述少见的、偶见的,并分别注明多见、少见、偶见等字样,以供参考。在进行描述工作中,检品特征被查见的难易有时会受到多方面的影响,从而导致描述的结果不准确。主要考虑下列5种情况:一是检验操作的问题,如取样没有代表性;二是粉碎度问题;三是药用部位的差异;四是掺杂的问题,如粉末中掺有其他物质;五是真伪的问题。如在鉴定工作中发现上述情况,应立即分析原因,根据不同情况采取解决措施后再进行描述。
(2)先特殊后一般各类药材粉末都具有一些为本类药材粉末所共有的组织和细胞等特征。共性特征,就大多数情况来说,对于具体药材的鉴定没有多大用处。所以在描述时应先重点描述比较特殊的组织、细胞以及内含物等,因为它们才具有鉴别的实际意义,而且在描述时应力求详尽。对于一般的特征,就大多数情况来说,只要在最后简单地提一句就可以了。此外,如果某类药材粉末应具有的组织细胞在检品中未被查出,则亦应注明,因为这是一种特殊情况,有助于鉴定结果的推断。例如皮类药材粉末检不出木栓细胞,则可以推断检品的药用部位是“内皮”。
(3)先感观后测试在对每一种细胞或细胞内含物进行描述时,应当先从感观入手,然后再对最易检出的特点来进行描述。
(四)电子显微镜鉴定技术
电子显微镜是20世纪30年代发展起来的现代化鉴定仪器,用于观察药材组织和细胞等的超微结构。电子显微镜主要分为透射电镜和扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)两大类。在中药鉴定工作中常使用扫描电子显微镜或分析电子显微镜。扫描电镜是由电子光学系统、信号接收显示系统、真空系统3大部分组成,此外,还有一些自动控制、自动补偿、图像处理等部件。
扫描电镜是利用电子探针(electron probe)在样品表面逐点逐行地扫描,收集样品产生的二次电子信号,用于观察样品形态特征的装置。它具有放大范围广、分辨率高(<100,1＝10^-4μm)、调节倍数方便、景深大、图像真实明显、样品制备简易、操作方便等特点。生物物体、器官或组织等样品制备过程比较简单,除一般生物制片或超薄切片能扫描观察外,不论是动植物药材还是矿物药材,均无须经过超薄切片和染色等处理,只要是完整的直径在12mm、厚3mm的物体或再稍大些的干燥样品,将其粘贴在支架上,在真空喷度器内镀上一层导电的金属膜(如金、钯、铝碳等)以保持样品表面处有恒定的电势,就能进行扫描获得微细结构特征。
扫描电镜技术主要用于研究光学显微镜下不易察见或图像不清晰、或难于判断的各种中药粉末微观特征的识别,以及花粉、叶类、果皮和种子类等中药表面特征的观察。目前在研究中药表面构造和细胞微观特征方面,均取得了不少具有重大意义的结果。如通过观察植物药的气孔、毛茸、腺体、蜡质、角质层、导管、纤维、石细胞、花粉粒、孢子和动物的体壁和鳞片等细胞和组织,以及矿物药的晶体等,对中药的品种鉴定提供了非常有价值的资料。研究曾发现:麻黄导管具有的麻黄式穿孔板是由具缘纹孔退化形成的;珍珠粉中的掺伪物珍珠层粉是斜方柱状排列成行的棱柱层碎片等,解决了中药鉴定中的部分理论和实践等方面的问题。

四、理化鉴定法

理化鉴定(physical and chemical identification)法就是利用中药中存在某些化学成分的化学性质和物理性质,通过化学的、物理的或仪器分析的手段,鉴定其真伪、纯度、内在质量,以及有害物质的有无或含量多少。
中药之所以能防治疾病,就是因为其中含有效物质。不同的中药有不同的功效,就是因为其各自所含的化学成分不同。也就是说,中药的质量优劣与其所含的化学成分有着密切的关系。所以,用化学或物理的方法来检查中药中的有效成分和有害物质的有无及含量是很重要的,这对于保证临床用药的安全与有效具有十分重要的意义。由于中药的数量繁多,成分复杂,加之很多中药的治疗作用尚未能用现代科学实验加以阐明,因而有效成分也不甚清楚,对于全面应用理化方法控制中药质量的工作还正在研究和探讨中。随着中药化学和分析化学等专业基础学科的进展,中药理化鉴定将会愈来愈完善和系统化。
(一)理化鉴定法的应用范围
在中药鉴定工作中,理化鉴定法主要应用下列几个方面:对含有不同化学成分的同名异物或性状相似且无明显显微特征中药的鉴别;对粉末、破碎的中药或其提取物,靠外观难以检查,而在其有效成分或主要化学成分已知的情况下,用理化鉴定作为鉴别真伪的一种手段;在研究中药或寻找代用品过程中,检查比较不同品种所含的有效化学成分的变化情况;对同品种,不同产地、批次、采收时间和贮藏期限等中药,在投料前进行初步比较,观察所含成分的变化情况,鉴定其是否符合规定的药用标准;对已有质量标准而且标准中规定有“鉴别”、“含量测定”的中药进行检查;对书刊上记载有化学成分的中药进行初步核对;对化学成分不明的中药进行探查,检查所含化学成分的性质和类型;检查中药不同药用部位所含的化学成分,从而确定有效成分的所在部位;用于中药提取物的鉴定;用于寻找各类中药的适宜采收期和中成药生产工艺的考察。因此,理化鉴定是中药品种鉴别和质量控制的一项重要内容。
(二)理化鉴定的一般方法
理化鉴定的方法根据应用的目的不同,可分为定性鉴定法和定量鉴定法两大类。定性鉴定法简称定性法,就是根据中药具有的各种特殊成分的化学性质和物理性质,进行的真伪鉴别。定性鉴定法根据性质又可以分为物理分析法、化学分析法和物理化学分析法。定量鉴定法简称定量法,就是根据中药含有的功效成分或主成分,测定其相对的含量,本法主要用于中药的质量评价和纯度检查。
理化鉴定法按照所采用的手段不同,一般可分为物理常数测定、化学定性分析、化学定量分析、微量升华(microsublimation)、色谱和光谱等方法,其中多数方法不但可以用于品种鉴定,也可以用于质量控制。故在下面重点介绍几种常用的鉴定方法。
1.物理常数测定法 即使用仪器或其他方法测定某些中药如挥发油类、油脂类、树脂类、加工品类、提取物以及某些液体中药的物理常数,以鉴定其真伪和纯度的一种方法。中药的有效成分现在已知的大多数是有机化合物,它们均有一定的物理常数,若掺有其他物质时,物理常数就会随之改变。常见的物理常数主要有:相对密度、熔点、凝点、折光率、比旋度、黏稠度、硬度、碘值、皂化值、酸值、馏程、膨胀度、色度、泡沫指数、溶血指数、体积比、溶解度等。
(1)相对密度鉴定法相对密度鉴定法是利用中药或其成分的相对密度(relative density)不同进行鉴定品种、纯度或质量的一种方法。液体中药常采用比重计、比重称和比重瓶测定法;固体中药一般采用直接法(排水法、排砂法)和间接法。如蜂蜜的相对密度应在1. 349以上,薄荷油的相对密度(25℃)为0.890～0.910,雄黄的相对密度为3.40～3.60。
(2)硬度鉴定法硬度(hardness)鉴定法是通过测定固体类中药或其制品对外界机械作用力的抵抗强度进行鉴定的一种方法,主要用于矿物类中药的鉴别。硬度的测定通常用具有一定硬度的标准物质来刻划定级,常采用直接法和间接法测定。如朱砂的硬度为2.0～2.5。
(3)熔点鉴定法熔点(melting point)鉴定法是利用中药中成分熔点的不同鉴定中药的一种方法。如冰片的熔点为205～209℃(供内服用)或205～210℃(供外用)。
(4)凝点鉴定法凝点(congealing point)鉴定法是利用中药中成分凝点的不同来鉴定中药的一种方法。一般按照现版药典的规定进行测定。如八角茴香油的凝点不应低于15℃ ;桉油精的纯度和含量不同其凝点不同,如含量45. 6%(g/g)时的凝点为24℃,而含量46.9%(g/g)时的凝点为25℃。
(5)泡沫指数和溶血指数鉴定法泡沫指数和溶血指数鉴定是利用皂苷的水溶液振摇后能产生持久性的泡沫和溶解红细胞的性质,可测定含皂苷类成分中药的泡沫指数或溶血指数作为鉴定指标。若有标准皂苷同时进行比较,则更有意义。进行溶血指数测定时,应说明温度和应用何种动物的血,以能产生溶血的最低浓度表示之。但由于此种溶血指数受动物特异性、生理状态以及放置温度、时间等方面影响极大,因此重复性较差。
(6)馏程鉴定法馏程鉴定法是利用中药中成分馏程(distiling range)的不同来鉴定中药真伪和检查纯度的一种方法,主要用于液体中药的鉴别。如松节油的馏程为154～165℃。
(7)折光鉴定法折光(refractometry)鉴定法是利用中药中某种或其所制成的液体折光率的不同来鉴定中药的一种方法,主要用于脂肪油、挥发油类中药的定性鉴别和水溶性成分在所成溶液中的定量。如满山红油的折射率为1.500～1.520。
(8)旋光鉴定法旋光鉴定法是利用中药中某种或其所制成的溶液比旋度(specific opticalrotation)的不同来鉴定中药的一种方法。如薄荷脑的比旋度为-49°～-50°。
此外,尚有多种物理常数可供实际工作中选用,其操作方法一般均应照现版药典中规定的方法进行。
2. 微量升华 微量升华是利用中药中所含的某些化学成分,在一定温度下能够升华的性质,获得升华物后,在显微镜下观察其升华物的形状、颜色或加某种化学试剂观察其化学反应作为鉴别的特征。必要时可用显微熔点测定器测定升华结晶物的熔点(melting point)。如斑蝥的升华物为白色柱状或小片状结晶(130～140℃),加碱溶解,加酸又析出结晶;小儿化毒散经微量升华可得冰片的结晶,其熔点应在205～210℃之间。
3. 电泳分析法 电泳(electrophoresis,EP)是一种分离和鉴定混合物中带电离子的技术,其原理是利用中药含有蛋白质带电荷的成分,在同一电场作用下,由于各组分所带电荷的性质、电荷数目以及分子质量不同,而泳动方向和速度不同,在一定时间内,各成分的泳动率不同,结合谱带数和染色不同达到鉴定的目的。本方法用于含有蛋白质和氨基酸类中药的鉴定,其特点是快速、准确、专属性强、灵敏度高、重现性好。鉴定对象多数为动物药类、植物药的果实和种子类、部分根及根茎类中药,以及含有上述成分的中成药。常用的方法有:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦凝胶电泳、不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、区带毛细管电泳、胶束毛细管电泳等。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)具有机械性能好、与被分离物质不起反应、对pH值和温度变化较稳定、重现性好、灵敏度高等优点。聚丙烯酰胺凝胶电泳是由丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,并以此为支持物的电泳技术。在电泳开始阶段,由于连续pH梯度作用,将供试品压缩成1条狭窄的区带(浓缩效应),从而提高其分离效果。
4.化学定性分析 化学定性分析是指利用某些化学试剂能与中药中的某种或某类化学成分产生特殊的气味、颜色、沉淀或结晶等反应,来作为鉴别真伪的手段。
一般来说,在对中药进行化学定性分析时,通常可用其提取液、粉末或切片等来进行。方法主要有下列几种:①将化学试剂直接加到中药表面、切片或粉末上,观察产生的结晶以及特殊的颜色反应;取切片或粉末也可装置在玻片或滤纸上,滴加相应的试剂进行直接观察。如山豆根中药材表面滴加10%氢氧化钠试液,立即由橙红色变为血红色(北豆根无此反应)。②取适量中药粉末于小试管中,加适当溶剂提出其化学成分。然后将溶液滴于玻片上、滤纸上或加入小试管中,滴加一定的试剂并观察其现象。③利用微量升华法,将中药中可升华的成分分出,加适当的试剂观察其化学反应现象。如牡丹皮粉末的微量升华物为丹皮酚,加三氯化铁醇溶液呈暗紫色。
在化学定性分析中,常针对某类特征性的化学成分进行定性检查,为了便于掌握,现将中药中常见化学成分的鉴别方法简介如下。
(1)含生物碱类成分的中药鉴别一般取中药粉末10g,加入10mL0.5%的盐酸乙醇溶液在水浴上加热回流10min。趁热滤过,得酸性乙醇提取液。取酸性乙醇提取液,用5%氢氧化铵溶液调至中性,至水浴上蒸干,在残留物上加5%硫酸(或加1%盐酸)使成酸性,滤过,滤液加生物碱试剂鉴别。如取溶液1mL加碘化铋钾试剂1～2滴,产生橘红色沉淀。但在进行生物碱检查试验时,必须有3种以上试剂均为正反应才能认为有生物碱存在的可能;提取液为同一浓度、同一体积时,所产生沉淀量的多少可初步显示生物碱含量的多少,以供参考。
(2)含有机酸类成分的中药鉴别一般取中药粉末5g,加水50mL,在50～60℃的水浴上加热1h,滤过(或取粉末5g,加乙醇50mL,在水浴上回流1h,滤过),滤液用pH试纸或喷洒0.1%溴麝香草酚蓝的乙醇溶液显色。
(3)含酚类、鞣质类成分的中药鉴别供试液制备方法同(2),可加三氯化铁等试液鉴别。值得注意的是:三氯化铁试剂与酚类成分反应产生的颜色随所用的溶剂、浓度、反应和观察时间,以及pH值等的不同而改变。有时需加热方能显色。
(4)含黄酮及苷类成分的中药鉴别一般取中药粉末10g,加入70mL甲醇,水浴上回流10min,趁热滤过,滤液加入浓盐酸及少量镁粉(或锌粉)等试剂进行鉴别。
(5)蒽醌类及其苷类成分的中药鉴别一般取中药稀醇提取液滤液1mL,加入1mL10%氢氧化钠溶液或1%醋酸镁甲醇溶液等进行鉴别。
(6)含强心苷类成分的中药鉴别供试液制备方法同(4)。可加入3,5-二硝基苯甲酸试剂或碱性苦味酸试剂等鉴别。
(7)含内酯、香豆素及其苷类成分的中药鉴别供试液制备方法同(4),可用异羟肟酸铁试验、重氮化试验和4-氨基安替比林-铁氰化钾试验等进行鉴别。
(8)含植物甾醇、三萜类成分的中药鉴别供试液制备方法同(4),可用冰醋酸-浓硫酸试验、氯仿-浓硫酸试验、三氯化锑试验和间二硝基苯试验等进行鉴别。
(9)含皂苷类成分的中药鉴别一般取中药粉末10g,加入100mL水,在60℃的水浴上加热10min,滤过。滤液供泡沫试验、溶血试验、李伯曼试验、浓硫酸试验、三氯醋酸试验和加Frode试剂等进行鉴别。
(10)含氰苷类成分的中药鉴别苦味酸钠试验:一般取中药粉末0.5g放入带塞试管中,加入3mL 5%硫酸溶液,充分混合。在试管口放1条浸泡过苦味酸盐溶液的滤纸条,塞紧,注意滤纸条不要接近溶液。将试管在沸水浴中加热10min,纸条变红色。
普鲁士蓝试验:取中药粉末置小试管中,管口用滤纸包住,滴加少量1%氢氧化钾溶液使湿润,于40℃水浴加热10min,在滤纸上加硫酸亚铁溶液、稀盐酸、10%三氯化铁试剂各1滴,滤纸显黄色。取中药粉末0.2～0.5g置试管中,加1～2滴水湿润,用塞塞住,内悬挂联苯胺-硫酸铜试纸,试管置40℃左右水浴中加热,试纸变蓝色。
(11)含硫苷类成分的中药鉴别一般取中药粉末少量加水研磨成糊状,在水浴上保温30～40℃,产生窜透性的辛辣气味。取中药粉末0.5g,加氢氧化钠如黄豆大1粒,加浓盐酸0.5～1mL,以新制醋酸铅试纸试验,显棕黑色并有光泽。
(12)含氨基酸、多肽和蛋白质类成分的中药鉴别一般取中药粉末2g,加水20mL,摇匀,室温过夜,滤过,滤液供以下试验。①加热或加酸沉淀试验:取1mL供试液,加热至沸,如出现混浊或沉淀时,表明含有蛋白质。加入1mL 5%硫酸溶液,也产生沉淀现象。②双缩脲试验:取1mL供试液,加1%硫酸铜溶液与40%氢氧化钠溶液等体积混合液数滴,振摇,显紫红色。③茚三酮试验:将供试液滴在滤纸上喷洒茚三酮试液,于110℃加热显紫红色斑点。
(13)含糖、多糖及其苷类成分的中药鉴别一般取中药粉末5g,加水50mL在50～60℃水浴上加热1h,滤过,滤液供以下试验。①斐林试验:取1mL供试液,加斐林溶液1mL,在沸水浴上加热数分钟,产生红色氧化亚铜沉淀(示有还原糖)。另取1mL供试液,加盐酸呈酸性,加热微沸数分钟,冷后用碳酸钠调节pH至中性,同上法加斐林试剂试之。如供试液在水解前呈负反应,水解后显正反应,或水解后产生氧化亚铜红色沉淀较前为多,表明带有还原糖的苷或为低聚糖与多糖类。②α-萘酚试验:取1mL供试液,加入5%α-萘酚乙醇溶液2～3滴,摇匀,沿管壁缓缓加入0.5mL浓硫酸,如在两液交界面处有紫色环,表明含有糖类或苷类。③多糖试验:取供试液5mL,在水浴上蒸发至1mL,加入2mL乙醇,如出现沉淀,滤过,并用少量乙醇洗涤,将沉淀溶解在2mL水中,按上述方法检查样品在水解前后的还原反应,以鉴定多糖的存在。取供试液与盐酸苯肼液共同加热,生成糖脎的黄色结晶物(取结晶物镜检,视结晶形状的不同可鉴定某些糖类)。
(14)含挥发油、油脂类成分的中药鉴别一般取中药粉末5g,加乙醚50mL回流提取,提取液添加乙醚适量,使全量约为50mL,通过6g氧化镁粉柱,流出液供以下试验。取10mL供试液,置表面皿上,在室温挥去溶剂,如有油状残留物并具芳香或特殊气味,加热后油状物消失或减少,表明有挥发油存在。如果加热后油状物不消失,加无水硫酸钠(或加硫酸氢钾)1～2粒,直接加热,有特异的丙烯醛气体产生;如果将此气体通入盛有席富试剂0.5～1mL的试管中,不久即呈紫红色,表明有油脂。5%磷钼酸乙醇液试验:将供试液滴在滤纸上,喷洒5%磷钼酸乙醇溶液,将滤纸放在115～118℃烘箱中2min,有油脂时呈蓝色。挥发油与脂肪油的区别,可采用下列方法进行:取油少量置2支试管中,分别加1mL95%乙醇与乙醚,如油在2种溶剂中均易溶解的是挥发油,如在乙醚中易溶而在乙醇中较难溶的为脂肪油。取含油的乙醚提取液滴于滤纸片上,如在溶剂挥发后纸上留下油迹者为脂肪油,反之为挥发油。同时可注意有无香气,挥发油一般具特异香气。
(15)含树脂类成分的中药鉴别一般取中药粉末少量置试管中,加水数毫升后进行加热,不溶解(树胶可逐渐膨胀与水相混成胶体液可以区别)。取中药粉末少量置试管中,加乙醚数毫升搅拌,可溶解(不溶者为树胶,树胶属多糖类)。将树脂类中药通过一定的方法分离,可确定树脂的类别及所含的主要化学成分。
5.化学定量分析 中药的化学定量分析是通过对中药含有的某种有效成分、有效部位群、杂质或有害物质的含量测定,来控制中药质量的一种方法。中药化学定量分析通常包括重量分析法和容量分析法两大类。
(1)重量分析法重量分析法通常是在一定的条件下,将被测中药中的组分用适当的方法提取、分离和净化后,干燥,恒重;或提取净化后,加入某些试剂进行反应,使产生难溶性沉淀物,再滤取沉淀,干燥,恒重。根据沉淀物和提取物的重量,来计算出被测成分在样品中的百分含量。重量分析法为经典的方法之一。它是用分析天平直接称量被测成分和反应物的,故准确度较高,但重量分析法需经滤过、洗涤、干燥等步骤,操作比较烦琐,费时多,由于中药的成分复杂,虽经提取净化,但往往仍为粗品,所以,重量分析法已逐渐被其他较快速、较准确的方法所代替。目前重量分析法主要用于《中国药典》规定的中药常规检测项目,包括水分、灰分、浸出物和挥发油的含量测定,以及某些生物碱和鞣质类成分的含量测定。重量分析法根据被测样品和被测组分的性质不同,故对被测样品所采用的分离方法也就不同,按对被测样品分离方法的种类,一般可分为沉淀重量法、萃取重量法、挥发重量法和电解重量法。挥发重量法主要用于中药水分和挥发油的含量测定;电解重量法主要用于矿物类中药的含量测定。
(2)容量分析法容量分析是根据一种已知浓度的溶液(所谓标准溶液或定规液)与样品中被测成分起完全反应时所用去的溶液体积,来计算出样品中被测成分含量的方法。这一方法,是通过滴定操作来实现的,所以又叫做滴定分析法。所谓滴定操作,就是将标准溶液由滴定管逐滴加到被测样品溶液中的过程。容量分析法与重量分析法相比较,具有操作简便、快速的特点,并易于掌握和操作。它应用的范围广,除可用于常量分析外,亦可用于测定微量组分。中药鉴定中常用的容量分析有酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化还原滴定法等。
6. 分光光度法 分光光度法(spectrophotometry)又称“光谱鉴定法”,它是通过测定中药中被测物质在某些特定波长处或一定波长范围内光的吸收度,对该物质进行定性和定量分析(quantitative analysis)的方法。药品分析一般用200～400nm的紫外光区;400～760nm的可见光区;2.5～25μm(或按波数计为4 000～400cm-1)的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。在紫外光区和可见光区,灵敏度和精度密较高,一般每1mL溶液中含有数微克的物质即可测定,误差在2%左右;在此区域内,物质对光的吸收主要是分子中电子的能级跃迁所致,同时伴随着分子振动和转动能级的变化,这种吸收光谱又称“电子光谱”;电子吸收光谱一般比较简单平缓,选择性不如红外光区,故主要用于定量分析及作为物理常数的测定。红外光区的灵敏度和精密度较低,一般需数百微克的供试品进行测定,在此区域内,物质对光的吸收系分子中振动和转动能级的跃迁所引起;红外光谱(或称振转光谱)的特征性很强,特别是在7～15μm一段(称为“指纹区”)吸收峰很多,而且尖锐,故主要用于物质的鉴别和结构分析。
(1)紫外光谱法紫外光谱法(ultraviolet spectrum,UV)是利用中药所含组分的不饱和程度及含量差异,导致其紫外吸收光谱峰位和峰强度的差别来达到鉴定的目的,常用的方法有吸收光谱法、导数光谱法(derivative spectrum,DS或称“微分光谱法”)、光谱线组法、百分吸收系数法等。其中以紫外吸收光谱为基础的导数光谱是解决光谱干扰的一种技术,它能校正无关吸收、排除干扰,获得信号尖锐、分辨率高的特点,能将重叠的光谱分开,尤其适用于亲缘关系较近的中药鉴别;紫外光谱线组法是一种多溶剂的紫外光谱综合分析法。
1)定性鉴别紫外光谱法用于中药的定性鉴别,主要根据光谱图所提供的参数,如最大吸收波长、最小吸收波长、肩峰及吸收系数等,作为鉴定的依据。其具体方法有以下几种:
比较吸收光谱的一致性;比较最大吸收波长(λ_max)、最大吸收波长时的百分吸收系数(E1%1cm)或摩尔吸收系数(∑λ_max)的一致性;比较吸收度比值的一致性;比较不同溶剂提取物的紫外光谱,并进行综合分析。
2)定量分析应用紫外分光光度法进行定量分析的原理,乃以Lambert-Beer定律为基础,即物质在一定波长处的吸收度与该物质的浓度之间呈线性关系。因此,只要选择一确定的波长测定溶液的吸收度,便可根据公式计算被测物质的浓度。此法不仅可对中药中单一组分进行定量分析,同时也可测定其混合物中某组分的含量。主要方法有标准曲线法和比较法。
(2)可见分光光度法可见分光光度法又称“比色法”(colorimetric method),它是通过比较中药溶液颜色对光的吸收度,以鉴定其某种成分或组分含量的方法,主要用于中药的定量分析和物理常数测定。使用本法进行鉴定时,应取对照品同时操作,除另有规定外,本法所用的空白溶液系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液,然后依次加入相应的同体积的同种试剂,并用同样方法处理。在规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸收度后,可按标准曲线法或比较法计算。
(3)红外光谱法中药的红外光谱(infrared spectrum,IR)鉴别是通过测定其粉末、提取物或化学单体的红外吸收曲线反映中药所含各组分官能团的差异,以鉴别中药的品种和质量,主要用于中药的定性鉴别和所含化合物的结构分析。
红外光谱法是以红外区域电磁波连续光谱作为辐射源照射样品,记录样品吸收曲线的一种物理光学分析方法,又称“红外吸收光谱法”。红外区的波长范围是在可见光与微波之间,习惯上按红外线的波长将红外波谱分成3个区段,即近红外区、中红外区和远红外区,其中中红外区是应用最广泛的区段。红外吸收光谱具有高度的特征性,对气态、固态和液态的样品均可进行分析,且分析速度快,样品用量少,操作简便,广泛用于化学单体和中药的定性鉴别。
进行红外光谱分析时,首先应根据对象不同,采用各种分离手段,保证供试品的纯度。供试品制备可根据物态的不同采用不同的方法进行,如液体样品采用液膜法和溶液法;固体样品采用压片法、糊剂法、薄膜法、溶液法;气体样品纯化后可直接用气体池进样测定。
1)定性分析(qualitative analysis) 对中药采用红外光谱定性,实质上就是解析红外光谱或与标准光谱进行对照,从红外光谱所提供的信息来确定未知中药的种类及其性质。在定性分析中,应选用适宜的样品处理方法及测量条件,以便与标准光谱进行对照。如血竭用红外分光光度法可检出不同来源的血竭和加工时的掺杂品,如达马胶等。
2)定量分析某化合物的某一官能团的特征吸收峰的强度与化合物的浓度成正比,利用这一原理,对中药中的成分进行定量。本法在中药定量分析中的优点是可供选择的吸收峰多,但缺点也比较明显,一是由于红外光谱纯度较差,通过仪器射出狭缝的谱带比较宽,因而定量误差较大;二是要求样品中待测化合物的纯度较高,否则吸收峰不易辨认。本法通常不用摩尔吸收系数或百分吸收系数计算浓度,而用工作曲线来求含量。本法精度一般是1%～2%,检出限量为0.1%～1.0%。一般在用其他方法定量困难时才考虑求助于本法。
(4)原子吸收光谱法原子吸收光谱法(atomic absorption sepctrophotometry,AAS)是基于从光源辐射出的待测元素特征光波通过供试品蒸气时,被蒸气中该待测元素的基态原子所吸收,测定辐射光强度减弱的程度,以求出供试品中待测元素含量的一种方法。原子吸收遵循一般分光光度法的吸收定律。比较对照品和供试品的吸收度,即可求得样品中待测元素的含量。本法用于中药中无机元素和杂质检查,测定方法主要有标准曲线法、标准加入法等。原子吸收光谱法所用仪器为原子吸收分光光度计。
(5)荧光光谱法荧光光谱法(fluorescent spectrum,FS)又称“发射光谱法”,是利用中药中的某些成分在吸收自然光或紫外光后能发生荧光的性质,对中药及其所含成分进行鉴定的一种方法。荧光分析(fluorometric assay)的常用仪器主要有荧光分析灯、光电荧光计、荧光分光光度计、显微荧光计等。
必须指出,并不是所有的中药或其成分都有发生荧光的性质。有些中药本身不发生荧光,但若用酸、碱或荧光染色处理后,就可能使某些成分在紫外光线下变为可见色彩。有的中药附有地衣或有多量霉菌生长,也可能有荧光出现,因此,荧光分析还可用于检查某些中药的变质情况。此外,在色谱分析应用上,也可能使吸附在色谱柱上、纸条上及薄层板上的各种成分产生荧光。
1)定性分析其方法主要有下列几种:一是直接取中药的饮片、粉末或其浸出液在紫外光下进行观察,如秦皮水浸液显碧蓝色荧光,日光下亦明显(含荧光物质秦皮甲素和秦皮乙素);二是本身无荧光的中药,经化学方法处理后,在紫外光下进行观察;三是利用荧光显微镜观察中药的粉末或切片。
2)定量分析利用被测物质的荧光强度和溶液浓度成正比的关系,对中药所含的成分进行含量测定。荧光分析用于物质的定量分析,测定方法与紫外光谱法基本相同,采用的方法有标准曲线法和比较法。本法对多组分混合物的分析,不经分离就可以测得被测组分的含量。在中药鉴定中,也可通过色谱等手段,先将供试品中的预测成分分离后,然后取样测定。
7. 色谱鉴定法 又称“层析法”,根据其分离原理,有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱(size exclusion chromatography)等。吸附色谱是利用被分离物质在吸附剂上被吸附能力的不同,用溶剂或气体洗脱使组分分离,常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱是利用被分离物质在两相中进行分配使组分分离,其中一相为液体,涂布或使之键合在固体载体上称为固定相;另一相为液体或气体称为流动相,常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换作用使组分分离,常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂,流动相一般为水或含有机溶剂的缓冲液。排阻色谱又称“凝胶色谱”或“凝胶渗透色谱”,是利用被分离物质分子量大小不同在填充剂上渗透程度不同使组分分离;常用的填充剂有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等,可根据载体和供试品的性质选用水或有机溶剂为流动相。分离方法有柱色谱法、纸色谱法(paper chromatography,PC)、薄层色谱法(thin-layer chromatography,TLC)、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱法反映的是中药提取物化学组成及含量情况,能定性定量地反映中药的鉴别特征,具有分离能力强、分析速度快、定量准确等特点。在进行色谱鉴定时,所用溶剂应与供试品不起化学反应,除另有规定外,应用纯度较高的溶剂;色谱时的温度,除气相色谱法或另有规定外,系指在室温条件操作。
(1)柱色谱法是利用中药中的化学成分在柱层析上层析发生分离、及其分离后各组分R_f值的不同进行鉴别。柱色谱包括吸附色谱和分配色谱。供试品可溶于固定液,混以少量载体,加在预制好的色谱柱上端。流动相需先加固定液混合使之饱和,以避免洗脱过程中两相分配的改变。
(2)纸色谱法纸色谱法是利用中药中的化学成分在特制层析用滤纸上层析发生分离、及其分离后各组分R_f值的不同进行鉴别。本法是以纸为载体,以纸上所含水分或其他物质为固定相,以流动相进行展开的分配色谱。所用滤纸应质地均匀平整,具有一定机械强度,必须不含影响色谱效果的杂质,也不应与所用显色剂起作用,以致影响分离和鉴别效果,必要时可进行处理后再用。
作为药品的鉴别,供试品所显主色谱斑点的颜色(或荧光)与位置,应与对照品所显主色谱斑点或供试品-对照品(1:1)混合所显的主色谱斑点相同。作为药品的纯度检查,可取一定量的供试品,经展开后,按各该药品项下的规定,检视其所显杂质色谱斑点的个数或呈色(或荧光)的强度。作为药品的含量测定,可将色谱斑点剪下洗脱后,再用适宜的方法测定,也可用色谱扫描仪测定。
(3)薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂均匀涂铺在玻璃板上(或其他支持物上,如铝制薄板)成一薄层,然后用毛细管或适当的点样器将样品液滴加在薄层的起始线上,待样点上的溶剂挥散后,置于密闭的色谱缸中,用一定的溶剂展开,当溶剂前沿到达距离另一端2～3cm处,取出,干燥,显色。样品中的混合物被分离,各成1个色点,测量起始线至各色点中心的距离,计算各色点比移植。薄层色谱的特点是展开时间短,分离效果好,灵敏度比纸色谱高,而且显色方便,可以直接喷洒腐蚀性的显色剂,并可加热进行鉴定。
薄层色谱中常用的吸附剂有氧化铝、硅胶和纤维素等。薄层板的制备有2种:一种是无黏合剂的,称为不黏合薄层,系将吸附剂(载体)直接涂布于玻璃板上即可;另一种是含黏合剂的,称为黏合的,称为不黏合薄层,系将吸附剂(载体)直接涂布于玻璃板上即可;另一种是含黏合剂的,称为黏合薄层,系在吸附剂或载体中加入一定量的黏合剂,用量的比例除特殊需要外,一般可用10%～15%煅石膏(CaSO₄·2H₂O在140℃烘4h)混匀后加水适量,或加羧甲基纤维素钠水溶液(0.5%～0.8%)适量调成糊状。均匀涂布于玻璃板上,置水平台上,空气中晾干,在110℃烘1h,放入干燥器中备用,薄层厚度一般在0.2～0.3mm之间。
1)薄层定性主要用于中药的真伪鉴别。在鉴定时,可取样品及标准中药按同样的方法提取,在相同条件下进行薄层展开和显色,比较二者所得色谱图谱是否相同。中药在进行薄层定性鉴定时,一般应有对照品。在目前条件下,对照品可根据不同中药的具体条件选用化学成分单体、粗提物或标准中药。目前,薄层色谱已经成为中药定性鉴别的常用方法。
2)薄层定量薄层定量分析的方法,主要分为两类。一类是对复合组分经薄层层离后,将待测成分从薄层板上刮下,再经洗脱后,选择适当的方法进行分析;另一类是直接在薄层板上,对已层离的待测成分进行测定。常用的定量方法主要有薄层洗脱测定法、薄层直接测定法、测量面积法。
(4)薄层扫描法系指用一定波长的光,照射在薄层层离后的色谱板上,对有吸收或能产生荧光的色谱斑点进行扫描,用反射法或透射法测定光束的强度检测层析谱的一种方法。可用于中药的有效成分和杂质的含量测定;对于中成药复方制剂,可用相应的原中药按需要组合作阴、阳对照,然后比较其薄层扫描图谱加以鉴别。薄层扫描的检测方法有吸收法(可见或紫外)和荧光法,测量方法有反射法和透射法,扫描方式有双波长和单波长、锯齿和线性扫描。各种供试品应选择适当的色谱条件展开后才能得到最佳的效果。一般对有吸收的样品,采用双波长、锯齿扫描、反射法;对能产生荧光的样品,采用荧光法;并可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明,结合样品特点,选择适宜的方法。采用薄层扫描仪对薄层上中药各组分斑点直接进行测定,具有方便、快速、测量灵敏度高的特点,它可测定出中药中某组分几微克的含量。
(5)毛细管相鉴定法毛细管相鉴定法是利用中药中所含的化学成分,经纸片毛细管作初步分离后,再与试剂显色进行鉴定的一种方法。常用于中药中有机酸、氨基酸、酚类和苷类成分的鉴别,常用的方法有毛细管吸附法和毛细管展层法。
(6)气相色谱法气相色谱法(gas chromatography,GC)主要用于含挥分性成分的中药鉴定。气相色谱法中流动相是气体,称为载气,通常用氮气(N2)和氦气(He)。固定相有2种,一种为固体吸附剂,称为气固色谱法(GSC);一种为涂在惰性固体表面的液膜,称气液色谱法(GLC),以GLC应用最为广泛。样品注入进样口被加热气化,在色谱柱内,样品中各组分在气、液两相中进行反复分配,因分配系数的不同而达到分离,先后由柱出口进入检测器,产生讯号,由记录仪记录色谱图。根据组分量与检测响应值(峰面积)成正比关系,进行定性和定量分析。气相色谱法精密度高,分离效果比薄层色谱好,速度快,但所得数据只有保留时间(retention time of a retain solution,tR),多数情况在高温下进行,若物质不能气化,就不能进行分析,故应用范围受到限制。
1)定性分析常用的方法有直接利用保留时间、相对保留值和保留指数谱(GCRIs)等。①直接利用保留时间定性:一定的物质在一定的色谱操作条件下,应有一定的保留时间,若仪器性能好,保留时间具有重现性。观察被测组分与对照品的保留时间是否一致,或将对照品与供试品混合后进样,看对应的色谱峰是否增大,即可加以鉴别。但不同的化合物可以有同样的或很相近的保留时间,在这种情况下,可用气相色谱与质谱(mass spectra,MS)、气相色谱与红外光谱(IR)的联用来进行确切的鉴别。②用相对保留值(或相对保留时间)定性:相对保留值是被测定组分的校正保留时间与基准物质的校正保留时间的比值(以RRT表示)。只要柱温、固定相确定,即使柱长、柱径、填充情况及载气流速等有所变化,也不影响比值。相对保留值的对数值与柱温的倒数有线性关系,用内抵或外推可得到不同温度下的相对保留值。因此,可以通过实测相对保留值与文献相对保留值对比进行定性,可不必取得各个纯物质即可做出鉴别。由于不同的物质可能在同一色谱柱上有相同的保留值,因而单用一根柱子无论用上述哪种方法均不太可靠,需用双柱定性,即选用2根不同极性的柱子来进行鉴别。③用保留指数(Ⅰ)定性:保留指数由Kovats首先提出,又称Kovats指数,即以2个相邻的正构烷烃为基准物质,测定它们的校正保留时间,使未知组分的校正保留时间在2个保留时间之间。
2)定量分析气相色谱定量分析的依据是组分的量(重量或在载气中的浓度)与检测的响应值(通常表现为峰面积)成正比。分析方法分为峰面积测量法和计算法两大类。峰面积测量法主要包括峰高乘半峰宽法、峰高乘基线宽度法、峰高乘保留时间法、剪纸称重法、积分仪测量法。计算法主要包括外标法、面积归一化法、内标法和追加法。
(7)高效液相色谱法高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)的原理与一般液相色谱十分相似,流动相均为液体,包括有液-固色谱、凝胶色谱、离子交换色谱和液-液色谱。高效液相色谱法的流动相是具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等,用泵将流动相压入装有填充剂的色谱柱,注入供试品(被流动相带入柱内),在填充剂上分离后,各成分先后进入检测器,用记录仪记录色谱图。所用的仪器为液相色谱仪,常用的色谱柱填充剂有:硅胶(用于正相色谱)、化学键合固定相(根据键合的基团不同用于反向或正相色谱;如十八烷基硅烷键合硅胶常用于反向或离子对色谱)、离子交换填充剂(用于离子交换色谱)、凝胶、玻璃微孔球(用于排阻色谱)等。样品注入量一般为数微升,柱温多为室温,紫外检测器。
本法与普通色谱法相比具有高速化或高效化的特点;与气相色谱法相比,因流动相为液体,固体样品只要求制成溶液,不需要气化,因而具有不受样品挥发性限制的优点,适用范围广。所以,本法可适用于中药中各类成分的鉴定。
1)定性鉴别包括色谱法鉴定法和非色谱鉴定法。①色谱法鉴定有保留特性法(保留时间或保留体积)、同系物的对数标绘法、检测器响应值的比值法等。常采用的联用检测器有:紫外与折光,折光与其他或两种不同波长的紫外检测器等。此外,还有官能团分析,放射性核素标记鉴定或利用酶、衍生物的反应使峰移位进行鉴定。②非色谱法鉴定:用于化合物鉴定的非色谱法很多,既有专属性的化学反应,又有各种仪器分析方法。运用这些检验方法,对流出液的组分进行检出,连同其保留特性,可以鉴定任一化合物。一般所用流动相应比待检出的组分易于挥发,这样可在较温和的条件下将溶剂除去。如果溶剂不易挥发,需采用适当的方法使溶剂与样品分离,以便于检出。
2)定量分析基本原理、要求与具体方法和气相色谱完全相同。其定量分析的过程一般分为4个步骤:色谱分离过程、峰面积测量、计算、实验数据的统计分析。计算方法有面积归一化法、内标法、外标法、主成分自身对照法。
8.质谱鉴定法 质谱是按照带电粒子(即粒子)的质量对电荷的比值(m/z)大小依次排列形成的图谱。质谱鉴定法(mass spectrometry,MS)用于中药的鉴别,可将中药的提取液置质谱仪中进行电子轰击,可获得提取物中化学成分的EI-MS图谱,不同中药的提取液所含的化学成分不同,所得质谱图所显示的分子离子基峰及进一步的裂解碎片峰也不一致,以资鉴别。该方法主要用于中药中化学成分的结构鉴定。在物质结构鉴定方面,可以通过各种“软”电力技术,得到被鉴定物质的分子离子峰(或准分子离子峰),从而得到被鉴定物的分子量信息,如利用激光解析技术把样品分子直接进入飞行时间质谱,目前已经可以得到样品分子准确的分子量。利用四级杆质谱或磁质谱所提供的信息,可以推断出被鉴定物的组成中可能有某些元素,利用高分辨质谱则更有可能较准确地判断出被分析物有哪些元素组成;再加上质谱中碎片离子所提供的信息,辅以IR、NMR、UV等提供的信息,可以推断出分子结构,或至少提出几种可能的结构以供选择。
9. 磁共振光谱鉴别法 磁共振光谱(nuclear magnetic resonance,NMR)与紫外、红外吸收光谱有相同之处,均是微观粒子吸收电磁波后在不同能级上的跃迁。所不同的是,磁共振光谱中是用频率为兆赫数量级、波长很长(0.1～100m)、能量很低的电磁波照射分子,在这种电磁波照射下,中药总提物中某些特定元素(通常选用H)的原子可以吸收电磁辐射,以吸收频率为横坐标,峰强度为纵坐标作图,即得该物质的磁共振氢谱(1HNMR)。中药的1HNMR指纹图具有高度的特征性和重现性,可依照¹HNMR指纹图上显示的特征共振信号和数据(δp_pm)鉴别中药。
用磁共振光谱鉴别中药,通常根据其所含有效成分或特征性成分的理化性质选择适当的溶剂提取分离工艺,制备其特征总提取物,测定¹HNMR指纹图,这样测得的中药¹HNMR指纹图主要显示有效成分或专属性成分特征共振信号,使鉴别结果更具准确性和科学性。
10. 色谱-光谱联用分析法 色谱-光谱联用分析法是将色谱和光谱分析仪器联用,通过对实验数据的综合分析,用以评价中药质量的一种方法。本法集中了色谱技术高分离效能和光谱技术高鉴别能力的优点,故广泛适用于中药的化学成分或组分的分离与含量测定。常用的方法有色谱-质谱、光谱-质谱和质谱-质谱(MS-MS)等。
(1)色谱-质谱鉴定法是将中药所含化学成分色谱分离的流分信息,通过电离源加以电离,然后进入高真空的质谱系统进行分析,得到有关分子离子峰质量的信息或被分析物离解谱的信息,用以鉴定中药一种方法。本方法是色谱与质谱技术相结合,具有多样化的进样系统、电离方式、用于化合物结构鉴定的功能和软件,以及快速、灵敏、准确、对样品处理要求简单等特点,可避免离线分析可能造成的样品量损失和变质问题,可以去除大量背景杂质的干扰,解决中药部分成分保留时间相近不易分离的困难。常用的色谱-质谱鉴定法有:高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)法和气相色谱-质谱法等。色谱-质谱技术的关键部件是电离源和质量分析器。主要鉴定方法如下:
1)高效液相色谱-质谱法高效液相色谱-质谱法,简称为“液相色谱-质谱法”,它是将中药液相色谱流出物中的被分析物电离成离子并与大量存在于流动相中的溶剂分子、缓冲剂分子等分离,然后进行质谱分析。如芩夏止喘颗粒中柴胡是君药,而柴胡皂苷是主要的有效成分之一,为了有效地控制该产品的质量,对柴胡皂苷进行了分析(图6-1)。从所选择的2种特定离子m/z=779和925可以准确无误地排除大量背景杂质的干扰,具有较强的专属性和灵敏度。
2)气相色谱-质谱法较之液相色谱-质谱联用,气相色谱-质谱法是一种成熟的技术。气相色谱-质谱法是将中药气相色谱流出物中的被分析物电离成离子,然后进行质谱分析。在实现气相色谱-质谱分析中,需要解决的2个关键的问题:气相色谱的大气压工作条件和质谱的真空操作条件相匹配的问题,以及前者较高的出峰速度;较窄的峰与质谱扫描的速度相匹配的问题早已在技术上得到解决。如复方丹参片含有冰片、三七、丹参浸膏。由于冰片与樟脑分子结构非常相似,气相色谱保留时间相近,故仅采用GC方法分析,难以准确定性。图6-2为冰片对照品溶液和供试品溶液进样后所得的气相色谱-质谱图,冰片由龙脑、异龙脑2种成分构成,所以出2个峰;复方丹参片提取液分析得到的最高峰(峰1)用NBS谱库进行质谱检索,检索结果却为樟脑,其后1个小峰(峰2)为冰片。樟脑与冰片的峰面积比大约是10,樟脑含量远远大于冰片。通过采用该种方法测定,得出了被检复方丹参片中的原料药掺有伪品的结论。

图6-1 复方中柴胡皂苷类提取物HPLC-MS图谱
1.负离子扫描总离子流图(TIC) 2.紫外检测所得谱图 3,4.m/z=779和925单离子扫描图

(2)质谱-质谱法质谱-质谱法又称“串联质谱法”,常缩写为MS-MS,指质量分离的质谱检测技术。它是通过离子在质谱仪中运动过程中发生的自然或人为的质量或者电荷的变化,研究母离子和子离子的关系,获得碎裂过程的信息,用于高灵敏度和高专一性的分析。这种串联的质谱方法可以由各种构型的质谱来实现。在MS-MS中,逐级地使母离子以及其碎片离子裂解,从所得的逐级裂解图谱中获得的信息比一级的质谱过程中所能获得的信息多,因此,对解析被分析物质的结构有很大的帮助。
11. X射线衍射法 X射线衍射法(XRD)是在“物相分析”原理的基础上,通过识别X射线衍射图谱中衍射峰的归属或建立图谱的几何拓扑规律、峰形的特征数值和模糊图像等,用以鉴别中药质量和纯度的一种方法。X射线衍射分析用于单一成分的鉴定历史较早,它具有图谱指纹性强、重现性好、操作简便等特点。对于一、二类新药一般要求附有粉末X射线衍射图谱。常用的方法有X射线衍射分析和X射线衍射傅里叶谱分析。
12. 聚类分析法 聚类分析法(cluster analysis)是在中药鉴定特征确定的基础上,应用模糊数学原理和计算机技术,将捕获的中药多种鉴别特征的主因子通过数学变换和数量化,对其进行数据计算和分析,或建立不同的动态聚类图,来研究中药信息鉴定模式的一种方法。主要方法有系统聚类法、动态聚类法、模糊聚类法等。本方法可提取反映中药来源、性状、显微、理化等差异的数量化特征,能够有效地消除部分干扰,并用计算机进行有效地鉴定。

图6—2复方丹参片气相色谱一质谱总离子流图
1．冰片对照品 2．复方丹参片

13. 热分析法 热分析法(thermal analysis)是通过热分析仪测量某些物质及其反应产物在程序控制温度条件下,根据其物理性能(如热能、质量等)的变化参数或热图谱来鉴别中药的一种技术。常见的方法有差热分析法(differential thermal analysis,DTA )、热重分析法(thermogravimetry,TG)和差热扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)等。该方法以用于矿物类中药的鉴定效果最佳。
(1)差热分析法是以某种在一定实验温度下不发生任何化学反应和物理变化的稳定物质作为参比物,与等量的未知物在相同环境中等速度温度变化的情况下相比较;未知物的任何化学和物理上的变化与和它处于同一环境中的标准物质的温度相比较,表现出暂时的升高和降低,根据其峰的温度和温度差来鉴别中药的一种方法。通常将供试品粉末与等量、等粒度的热中性物(参比物,如三氧化二铝、氧化镁等)分别置同一高温炉中加热,在加热过程中随温度的变化,供试品发生吸热或放热效应,供试品与热中性物质之间的热差通过热电隅,用差热电流计检出,再将电流信号变成差热反应曲线(DTA曲线),通过供试品与对照品的差热曲线的比较进行中药的鉴定。曲线上的峰向下为吸热效应,峰向上为放热效应,吸热峰产生的原因有结晶的转变、熔融、气化、升华、脱附、吸收与析出、脱水、分解、还原等;放热峰产生的原因有结晶变化、吸附及分解、氧化等。如用于牛黄、女贞子的真伪鉴别。
(2)热重分析法是利用物质在加热过程中发生质量变化的特性进行鉴定。如中药在加热时因脱水、分解等,失去一部分重量,通常用热天平测定其在不同温度下所失去的重量,而获得热重分析曲线(TG曲线)。该曲线以温度为横坐标,质量为纵坐标,以供试品起始重量坐标为0点;曲线向上表示增重,曲线向下表示失重,直线表示无重量变化。此法主要用于含水矿物类中药的鉴定,亦可用于珍珠粉、阿胶等中药的鉴别。
(3)差热扫描量热法是利用测量供试品与对照品的功率差与温度的关系,所记录的是DSC曲线。典型的DSC曲线以热流率(dH/dt)为纵坐标,以时间(t)或温度(T)为横坐标。曲线离开基线的位移,代表样品吸热或放热的速率(mJ/s);曲线中的峰或谷所包围的面积代表热量的变化。如用于乳香的品种鉴别等。
此外,还有计算机图像分析法、电化学鉴定法(electrochemical identification methods)、模式识别法(pattern recognition)、等离子体光谱法(ICP)等先进的技术应用于中药鉴定,这些新技术的应用,将逐渐引导中药鉴定向标准化、信息化的方向发展。

五、生物鉴定法

生物鉴定(bioassay)法又称“生物检定法”或“生物测定法”,是利用中药或其所含的化合物对生物体(organism)的作用强度,以及用DNA特异性遗传标记特征和基因表达差异等来鉴别中药的品种和质量的一种方法。通常分为生物效应鉴定法和基因鉴定法两大类。
生物效应鉴定法是利用药物对于生物(整体或离体组织)所起的作用,测定药物生物活性(biological activity)强度或药理作用,以鉴别中药真伪优劣的方法。该法以药理作用和分子生物学为基础,以生物统计为工具,运用特定的实验方法和病理模型,通过被测物与相应的对照品在一定条件下比较其产生特定生物反应的剂量比例,测出药物的活性作用。常用的方法有免疫鉴定法、细胞生物学鉴定法、药物效价测定法和单纯指标测定法等。基因鉴定法包括DNA (deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸)遗传标记鉴定法和mRNA(messenger ribonucleic acid,信使RNA)差异显示鉴定法等。现将生物鉴定法的主要内容简述如下。
(一)免疫鉴定法
免疫鉴定法是利用中药含有的特异蛋白为抗原制备的特异抗体,与供试品中特异抗原结合产生沉淀反应的一种方法。它是通过制备特异抗原试剂,采用免疫电泳(immunoelectrophoresis)或琼脂免疫扩散等方法达到鉴定目的的。本方法具有特异性强的特点,可以准确地进行中药的品种鉴别。
(二)细胞生物学鉴定法
细胞生物学鉴定法主要是采用染色体(chromosome)的分类技术对中药进行鉴定。中药某个特定种群的生物体细胞中染色体的形态、组型、带型是稳定不变的,代表着该种群的基本遗传特征,根据该特征即可以鉴定中药的品种。由于染色体形态只能在细胞分裂的中、后期观察,故本方法主要适用于果实和种子类等中药的鉴定。本法根据染色体的排列,制成核型模式图;或用“不对称核型分类”标准确定其核型,并与染色体的背景资料比较,达到鉴定的目的。如对中药栀子的鉴别等。
(三)生物效价测定法
生物效价测定(estimation of biological potency)法就是测定药物对生物机体某方面作用的强度。如对黄连、黄柏、黄芩等具清热功效中药的抑菌率或抗菌效价(titer)的测定,对洋地黄强心指标生物效价的测定等。药物效价测定法是利用生物体的反应来鉴定中药有效成分的含量或效价,测定药物的疗效和毒性(toxicity)的方法。
有些中药,如洋地黄及其制剂、铃兰毒苷及其注射液,到目前为止还没有找到一种比较合适的化学分析方法来确定它们的有效成分含量或效价。所以,就宜用生物效价测定。生物效价测定法的主要原则是将供试品与对照品(包括中药,纯成分)在严格规定的条件下,比较它们对生物体所产生的反应强度,再计算出中药或其制剂的剂量标准。中药的效价通常以1g中药中所具有的“作用单位”数来表示。这种单位是指在一定条件下所表现一定生理作用的最小剂量。例如,《中国药典》规定洋地黄制剂的质量标准:洋地黄叶(Folium Digitalis)要保证同样洋地黄制剂的各种商品的效价一致,而并不是为了使不同的精制强心苷效价相等。因为这种方法不能把它在肠内吸收的差别、作用的快慢以及效力的久暂等估计在内。鉴于现时尚缺乏可靠的定量法,故可利用动物试验以检定药物的效力。此种生物效价测定法包括蛙法、猫法、豚鼠法及鸽法等。
(四)纯指标测定法
单纯指标测定法就是测定某药物或某类药物某一特性或某一药理作用的强弱。如对含皂苷类中药溶血指数的测定,如使用溶血法鉴定柴胡和大叶柴胡;对含苦味中药苦味指数的测定;对含蒽醌类大黄的泻下作用的测定;对青黛中靛玉红、两头尖中竹节香附素A抗癌活性的测定;黄芪中黄芪皂苷甲、三七中三七皂苷降血压和扩张血管作用的测定;对人参中人参多糖、刺五加根中刺五加多糖和红花中红花多糖免疫作用的测定;对三七抗凝血作用的测定等。
(五) DNA遗传标记鉴定法
DNA分子是由G、A、C、T 4种碱基(base pairs,bp)构成,为双螺旋结构的长链分子,生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基排列序列中,遗传上的差异则表现在4种碱基排列顺序的变化之中,这就是生物的遗传多样性。比较物种间DNA分子的遗传多样性的差异来鉴别物种就是DNA分子遗传标记鉴别。在DNA分子上,有编码与物种密切相关的基因区域、不十分密切相关的基因区域和非编码基因区域。这些基因区域在生物进化过程中所受的压力不同,前者所受选择压力大,表现出高度的保守性;后者所受选择压力小,表现出较大的差异性。正是这种压力的不同,使得DNA分子的不同区域有不同程度的遗传多样性。因此可以选择适当的DNA分子遗传标记,在科、属、种、亚种、居群和个体上对研究对象进行鉴别。
动、植物类中药材大多数是死亡的干燥生物体或生物的组织器官、分泌物等,而在生物体死亡的过程中,细胞会产生核酸酶大量降解DNA,这就给中药材的DNA分析带来了困难。近年来,随着分子生物学技术的飞速发展,特别是微量DNA提取技术和多聚酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)技术的发展,使从中药中提取微量的DNA进行分析成为现实,也为用DNA技术对中药材种质资源的鉴定奠定了基础。
DNA遗传标记鉴定法是根据不同生物类中药个体遗传物质DNA的差异来鉴定中药的一种方法。动、植物的外部形态和所含化学成分的多少往往随生态环境的改变而发生变化。中药(特别是植、动物中药)的形状随入药部位、加工方法的变化而变化,这些变化常给中药的鉴定带来困难。众所周知,动、植物依靠细胞分裂繁衍后代,在这种繁殖过程中亲代将保持种群外部形态、组织功能、生理和生化特征等遗传信息遗传给子代,即在细胞分裂的过程中遗传物质由亲代遗传给子代。大量的研究证明,遗传物质存在于细胞核中,细胞核中的染色体是遗传基因的载体。染色体的数目和形态是动物和植物体内比较稳定的重要特征。在由DNA、RNA和蛋白质组成的染色体中,DNA是绝大多数生物(除少数病毒外)的遗传物质。同种生物的细胞中具相同的DNA,不同种生物的细胞中具不同的DNA。采用细胞与分子遗传学技术鉴定中药就是以上述理论为依据,借助相应的技术达到鉴定的目的。该方法分为细胞遗传学技术和分子遗传学技术2大类。例如采用分子遗传学技术鉴定鸡内金,即利用微量DNA提取技术,从鸡内金(鸡Gallus gallus domesticus Brisson的干燥沙囊内壁)中提取DNA,以线粒体DNA细胞色素b (mtDNA cyt b)通用引物中的L14 841和H15 149为引物,进行DNA特异性扩增片段的PCR反应,并测定其DNA 143碱基序列,能区分鸡内金和鸭内金。
采用DNA遗传标记鉴定中药的主要方法有:DNA序列测定法,随机扩增多态性DNA指纹分析(random amplified polymorphic DNA,RAPD),任意引物PCR反应技术(arbitrarily primedPCR,AP-PCR),限制性内切酶酶切片段长度多态性分析(restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP),PCR扩增特定片断的限制性位点分析等方法。
(六)mRNA差异显示鉴定法
mRNA差异显示鉴定法是利用中药不同组织或细胞在基因表达(gene expression)上的差异进行鉴定的一种方法。它通过将总RNA反转录成单链cDNA (complementary DNA),然后进行PCR扩增反应,分离出不同分子大小的DNA,挑选出有差异的表达基因进行序列分析。既可以制备探针用于稳定灵敏的检测实验,也可以制备其蛋白产物及其抗体进行免疫检测。采用该技术,可以提炼出栽培和野生、道地和普通药材等之间的特征,可望广泛用于中药的品种和质量鉴定。

第节　中药鉴定知识的起源与本草 ♂

第节　中药鉴定知识的起源与本草第1节　中药鉴定知识的起源与本草 : 中药鉴定知识是人类在长期与疾病做斗争的医疗实践中产生和丰富起来的,它经历了漫长的发展过程。追溯到远古时代,人们在寻找食物的同时,发现了许多具有特殊作用的植物可以用来防治疾病,这些发现的内涵则是鉴定知识的起源。相传在公元前有“神农尝百草之滋味……一日而遇七十余毒”的说法。也就是说,中药鉴定的知识是随着中药的发现而产生的,在没有文字的太古时代,这些知识只能依靠师承口授流传后世。有了文字以后,中药鉴定的知识逐渐间接或直接地被记录下来,出现了医药书籍,古代记载中药的著作称为“本草”(herbals),从秦汉时期到清代,本草著作约有400种之多。
《诗经》是我国现存文献中最早记载有药物的书籍,该书叙述了葛、苓、芍药、蒿、芩等50多种药用植物的采集、性状、产地等知识,已有了初步的性状鉴别方法。《淮南子》载有秦皮“以水浸之正青”的水试鉴别法。《山海经》中有十巫采用百药的记载。《周礼·天官》载有“医师掌医之政令,聚毒药以供医事”,并有草、木、虫、石、谷“五药”的记载。《五十二病方》中收载了247种中药材、283首中药处方和饼、曲、酒、丸、散等中药剂型。
我国已知最早的药物学专著首推《神农本草经》(三卷)。成书于东汉末年,作者不详,载中药材365种,按医疗作用分为上、中、下三品(three grades of drugs),其中植物药252种、动物药67种、矿物药46种。从所记载的药名推求,当时已经具备了较为完整的性状鉴别方法,如人参、丹参、木香、苦参等,均与经验鉴别的看法、嗅法、尝法有关。此外,还有“丹砂能化为汞”的记载,属于早期的理化鉴别方法之一。该书总结了汉代以前有关中药的基本理论和基本知识,提出了“药有土地所出,真伪新陈”等中药质量鉴定的问题,为后世中药鉴定学的发展奠定了基础。
公元220～265年,《吴普本草》记载了40余种中药材的形态识别方法,有钟乳石“聚汁所成,如乳汁,黄白色,中空相通”等完整的描述,可谓是最早较完整地记载中药性状鉴别内容的本草著作。公元304年,晋·嵇含撰成《南方草木状》一书,收载了我国广东、广西等地区的植物80余种,并按植物的属性分为草、木、果、竹4类,其中大多数为常用中药材,如使君子、槟榔等,主要叙述了形态和功能。继之的《名医别录》,突出地记载了中药材的产地和生长环境,对中药材的形态描述有所增加。在这一时期,已经十分注重中药材的来源鉴别。
公元420～479年,南北朝时期刘宋时代,雷敩撰写了《雷公炮炙论》,该书对中药质量鉴别方面的内容记载颇多,出现了采用比重法评价中药材质量的实例。如对沉香的质量评价为:“沉水者为上,半沉水者次之,不沉水者劣”。药材鉴定单凭文字记述不易详尽,也不易理解。公元5世纪,出现了早期的药图,这在中药鉴定学的发展史上是一大进步。最早的中药图谱可能是《芝草图》,借鉴图谱鉴别药材,一目了然。
公元502～536年,梁·陶弘景著成《神农本草经集注》(七卷),该书收载中药材730种,并将药材分为玉石、草木、虫兽、果、菜、米食、有名未用7类,堪称药材依自然属性分类的先导性著作。该书记述了各药材性能、产地、采收、加工、经验鉴别等内容,尤其重视中药材真伪优劣的对比鉴别,指出了当时中药材市场上品种和质量存在的混乱现象。如对“术”的鉴别,认为术有白术和赤术两种;药市上有“钟乳醋煮令白,细辛水浸令直……以虺床为蘼芜、荠苨乱人参”等现象。
公元659年,唐·李勣、苏敬等22人撰成《新修本草》(五十四卷),该书又称《唐本草》,载药850种,按药材的属性分为11部。该书由政府颁布,是世界上第一部由国家颁行的药典,他比欧洲地方性的《佛洛伦斯药典》(1498年)早839年,比欧洲第一部全国性的《丹麦药典》(1772年)早1113年。该书采用了图文并行的编写方式,有本草20卷、目录2卷、图经7卷、药图25卷,图文并茂,可谓较为完整的中药材图文鉴别方法的专著。该书出版不久即流传到国外,对世界医药的发展做出了重要贡献。
公元741年,陈藏器著成《本草拾遗》(十卷),收载了《新修本草》未载的中药692种,该书提出了按照药效宣、通、补、泄、轻、重、燥、湿、滑、涩的分类方法,在内容上重视中药的性味功能、生长环境、产地、形态描述、混淆品种考证等。尤其对药材的描述真实可靠,如海马“出南海,形如马,长五六寸,虾类也”。大约在公元908～923年,《日华子诸家本草》(二十卷)对中药的形态、炮制、性味功能等记载颇详,书中有采用水试法综合鉴定品种和质量的记载:如地黄“生者水浸验,浮者名天黄,半浮、半沉者名人黄,沉者名地黄。沉者力佳,半沉者次之,浮者劣。”
公元973年,宋·刘翰、马志等撰成《开宝新详定本草》(二十一卷),简称《开宝本草》,载药983种。为了加强中药的质量管理和普及中药鉴别知识,1061年,苏颂等校注药种图说,编成《本草图经》(二十一卷),对中药的产地、形态、用途等均有说明。该书首创版印墨线药图,图的绝大多数为实地写生绘制,药图的名称大多冠以州县名,反映了当时十分重视道地药材和药材的质量评价。该书是后世本草图说的范本,但已亡佚,其所载药图930余幅均在其他本草中得以保存。
1108年前,北宋·蜀医唐慎微汇集了前代主要本草中有关中药鉴定的内容,编撰了《经史证类备急本草》(三十一卷,简称《证类本草》),该书载药1746种,是研究中药鉴定方法的重要文献,也是现存最早、最完整的本草著作。1116年,著名的药物学家寇宗奭,根据实地考察和医疗实践经验,著成《本草衍义》(二十卷),该书载药470种,侧重药材的鉴别,提出了药材产地与质量关系的论点,甚为后世推崇。
中药鉴定的知识在明代得到了进一步总结。1505年,刘文泰等编写了《本草品汇精要》(四十二卷),该书载药1815种,分别以苗、形、色、味、嗅等项逐条记载了与性状鉴别有关的内容,并附有彩色药图,具备了现代中药性状鉴定法的雏形。1566年,陈嘉谟在《本草蒙荃》(十二卷,载药742种)一书中对中药材的“生产择土地”、“收采按时月”、“贸易别真假”进行了专述。提出了药用植物体与其生长环境统一的规律性、不同药用部位采收的一般规律,以及产地与药材质量的关系。对中药市场(drug market)掺伪作假的现象进行了详细调查,指出了“当归酒浸润、枸杞子蜜拌为甜、蜈蚣朱其足”等以劣充优的现象。该书收载了28幅药材图,部分还显示了药材断面的特征。
1593年,李中立总结了明代以前的中药鉴别经验,著成了《本草原始》,全书载药材图379幅,其中绝大多数是药材写生图,图旁注有药材的优劣标准。该书被称为我国最早的一部药材鉴定性质的本草著作。
1596年,明·李时珍著成《本草纲目》(五十二卷),载药材1892种、药方11096首、药图1109幅。该书自立分类系统,将药材按其来源的自然属性分为16部60类。该书对中药材的性状鉴别记载较为完善,如对樟脑的描述为:“状似龙脑,白色如雪,樟脑脂膏也”。《本草纲目》不仅继承了唐、宋时代本草图文并茂的优点,而且把所有的药材鉴定内容归于“集解”项下,使之条理化。
清代,中药鉴定的知识比较普及,很多本草著作中都谈到了中药鉴定的知识。但除了在具体经验方面不断增加,同时更多地将药材的形、色、气、味与中药药理相结合之外,在中药鉴定方面没有特别值得称道的发明。1765年,赵学敏著成《本草纲目拾遗》(十卷),载药材921种,书中有716种中药材是《本草纲目》中未记载的,它是清代新增中药材品种最多的一部本草著作。1848年,吴其濬编著了《植物名实图考长编》(二十二卷)和《植物名实图考》(三十八卷),分别收载植物838种和1 714种,该书虽非药物学专著,但其中记载了很多药用植物,对现代植物药的来源鉴定和考证亦有重要的参考价值。

第节　概述 ♂

第节　概述第1节　概述 : 中药质量标准是对中药质量及其检验方法所作的技术规定,用于指导中药生产、经营、使用、检验和监督管理,以保证药品的安全性、有效性、稳定性和可控性。中药质量标准的制定是中药研究中重要的组成部分,进行中药的新药研究,必须依据国家《新药审批办法》的要求制定临床研究和生产使用的质量标准。质量标准具有权威性、科学性、先进性等特征。权威性是指质量标准具有法律效力,如国家《药品管理法》中规定:药品必须符合国家药品标准或省(市、自治区)药品标准,虽然各国均不排除生产厂家可以采用非药典方法进行检验,但需要仲裁时,只有各级法定标准、特别是国家药典具有权威性;科学性是指质量标准对具体对象研究的结果有适用性的限制,在不同成药中鉴定某一相同药味成分,不一定方法均能适用,但其方法的确定与规格的制定均有充分的科学依据;先进性是指随着生产技术水平提高和检测方法的改进,应对药品标准不断进行修订和完善,使得标准中检测指标专属性更强、检验技术更加先进、质量评价方法更加科学,限度标准制定更为合理,但处方、原料、工艺绝不允许有任何改动。

一、中药质量标准的分类

(一)国家标准
国家标准是国家颁布的有关药品标准,包括药典和部颁药品标准。国家标准是对产品的最低要求和基本标准,凡是国家标准中收载的产品,在生产中都必须遵照执行。国家标准的基本要求是:具有国内的先进水平;有可控性和重现性。新药经批准后,其质量标准为试行标准;批准为试生产的新药,其标准的试行期为3年。
(二)地方标准
地方标准是各省(市、自治区)制定的药品标准。批准使用的标准,试行期为2年,试行期过后,可转为部颁标准。
(三)企业标准
企业标准是企业根据生产需要制定的药品标准。一般有两种情况:一种为检验方法尚不够成熟,但能达到一定的质量控制作用;另一种为高于法定标准的要求,常常增加检测项目或提高限度标准。企业标准是企业作为创优、市场竞争、保护优质产品、严防假冒等采用的重要措施。

二、制订质量标准的条件

中药质量标准的制定必须具备3个条件,即:处方组成固定、原料来源和制备工艺稳定。
(一)处方固定
中药处方药味及份量是制定质量标准的依据,直接影响评价指标的选定和限度的制定。因此在制定质量标准之前,必须要求处方准确无误,才可以进行质量标准的研究和实验设计。
(二)来源(中药材、饮片)稳定
中药材除了药用部位、产地、采收加工、贮藏等因素涉及质量优劣外,还应特别重视的是其真伪与地区习惯用药品种的鉴别和应用。
(三)制备工艺稳定
新药研制在处方确定后,结合临床服用要求确定剂型,进行制备工艺研究,优选出最佳工艺条件,进行中试,达到设计要求后,方可进行质量标准的制订。因为尽管处方相同,如果工艺不同,所含的成分必然有所差别,直接影响鉴别、含量测定等项目的建立和限度的规定。

三、质量标准研究的内容

(一)中药材(含饮片)质量标准
中药材(含饮片)的质量标准包括:名称、汉语拼音、药材拉丁名、来源、性状、鉴别、检查、浸出物、含量测定、炮制、性味与归经、功能与主治、用法与用量、注意及贮藏等项内容。
1. 名称 包括中文名称、汉语拼音、药材拉丁名,按中药命名原则要求制定。
2. 来源 来源包括原植(动、矿)物的科名、中文名、学名、药用部位、采收季节和产地加工等,矿物药包括矿物的类、族、矿石名或岩石名、主要成分及产地加工。中药材均应固定其产地。
(1)基原需经有关单位鉴定,确定原植(动)物的科名、中文名及学名;矿物的中文名及拉丁名。
(2)药用部位指植(动、矿)物经产地加工后可药用的某一部分或全部。
(3)采收季节与产地加工是指能保证中药材质量的最佳采收季节和产地加工方法。
3.性状 系指中药材的形状、颜色、表面特征、质地、断面及气味等的描述,除必须鲜用的按鲜品描述外,一般以完整的干药材为主;易破碎的中药材还须描述破碎部分。描述要抓住主要特征,文字要简练,术语需规范,描述应确切。
4.鉴别 选用的方法要求专属、灵敏。包括经验鉴别、显微鉴别(组织切片、粉末或表面制片、显微化学)、理化鉴别(色谱、光谱鉴别等)及其他方法的鉴别。色谱鉴别应设对照品或对照中药材。
5.检查 包括杂质、水分、灰分、酸不溶性灰分、重金属、砷盐、农药残留量、有关的毒性成分及其他必要的检查项目。
6.浸出物测定 可参照《中华人民共和国药典》现行版附录浸出物测定法要求,结合用药习惯、中药材质地及已知的化学成分等选定适宜的溶剂,测定其浸出物量以控制质量。浸出物的限(幅)度指标应根据实测数据制订,并以中药材的干品计算。
7.含量测定 操作步骤叙述应准确,术语和计量单位应规范。含量限(幅)度应根据实测数据制订。在建立化学成分的含量测定有困难时,可建立相应的图谱测定或生物测定等其他方法。
8.炮制 根据用药需要进行炮制的品种,应制订合理的加工炮制工艺,明确辅料用量和炮制品的质量要求。
9.性味与归经、功能与主治、用法与用量、注意及贮藏等项 根据该中药材研究结果制订。
(二)中药制剂质量标准
中药制剂必须在处方固定和原料质量、制备工艺稳定的前提下方可拟定质量标准草案,质量标准应确实反映和控制最终产品质量。质量标准的内容一般包括名称、汉语拼音、处方、制法、性状、鉴别、检查、浸出物、含量测定、功能与主治、用法与用量、注意、规格、贮藏、有效期等项目。
1. 制剂的质量标准
(1)名称名称包括中文名、汉语拼音,可按中药命名原则的要求制订。
(2)处方处方应列出全部药味和用量(以g或mL为单位),全处方量应以制成1000个制剂单位的成品量为准。药味的排列顺序应根据组方原则排列。炮制品需注明。
(3)制法制法的主要内容如下:须写明工艺的全过程,在保证质量的前提下,不宜规定得过细;辅料、剂型、总量主要叙述处方共有多少味药,各味药处理的简明工艺路线、工艺条件及中间体质量,使用药引、辅料的名称及用量,制成的剂型,制成品数量等;制备工艺中对质量有影响的关键工艺,应列出控制的技术条件、关键半成品的质量标准,如粉碎的细度、浸膏的相对密度、乙醇浓度等;制法中药材粉末的粉碎度可用“粗粉”、“中粉”、“细粉”、“极细粉”等表示,也可列出筛目;对蜜丸的用量因各地的气候、习惯等不同,可规定一定的幅度,但幅度不宜过大,以免影响用药剂量。
(4)性状性状是指剂型及除去包装后的色泽、形态、气味等的描述。性状的确定通常是依据样品除去包装后的实际情况拟定,必须是中试产品或大生产样品。片剂及丸剂有包衣的,应除去包衣,以片芯或丸芯依次描述。硬胶囊应除去囊壳描述。外用药不描述气味。
(5)鉴别鉴别方法包括显微鉴别、理化鉴别等,要求专属性强、灵敏度高、重现性较好。显微鉴别应突出描述易察见的特征。化学、光谱、色谱鉴别,叙述应准确,术语、计量单位应规范。色谱法鉴别应选定适宜的对照品或对照中药材作对照试验。
(6)检查参照《中华人民共和国药典》现行版附录各有关制剂通则项下规定的检查项目和必要的其他检查项目进行检查,并制订相应的限量范围。药典未收载的剂型可另行制订。对制剂中的重金属、砷盐等应予以考察,必要时应列入规定项目。
(7)浸出物测定根据剂型的要求,参照《中华人民共和国药典》现行版附录浸出物测定法的有关规定,选择适当的溶剂进行测定。
(8)含量测定含量测定应首选处方中的君药(主药)、贵重药、毒性药,制订测定的项目。如有困难时则可选处方中其他药味的已知成分或具备能反映内在质量的指标成分建立含量测定方法。如因成品测定干扰较大并确证干扰无法排除而难以测定的,可测定与其化学结构母核相似、分子量相近总类成分的含量,或暂将浸出物测定作为质量控制项目,但必须具有针对性和控制质量的意义。含量测定方法可参考有关质量标准或有关文献,也可自行研究后建立,但应作方法学考察试验。含量限(幅)度指标,应根据实测数据(临床用样品至少有3批、6个数据,生产用样品至少有10批、20个数据)制订。含量限度一般规定低限,或按照其标示量制订含量测定用的百分限(幅)度。毒性成分的含量必须规定幅度。含量限度低于万分之一者,应增加另一个含量测定指标或浸出物测定。在建立化学成分的含量测定有困难时,也可考虑建立生物测定等其他方法。
(9)功能与主治、用法与用量、注意及有效期等均根据该药的研究结果制订。
(10)规格应制订制剂单位的重量、装量、含量或1次服用量。
2.原料(中药材或饮片)及辅料的质量标准 处方中的组分均应符合法定药品标准。
(1)复方制剂中若含有未制定药品标准的中药材应先制定其省级质量标准,按照《新药(中药材)申报资料项目》中的有关要求报送资料,其资料随制剂一起上报。包括:中药材名称(中文名、汉语拼音、拉丁名)及命名依据;中药材的来源及其鉴定依据;生态环境、组织特征、理化鉴别等研究资料(方法、数据、附图和结论)及文献资料;中药材的质量标准及起草说明,对照品及有关资料;中药材的稳定性试验资料、结论和有关文献资料;按质量标准提供有代表性样品至少3批及其检验报告书,并提供原动、植、矿物及引种(养)中药材原产地的动、植、矿物标本各2份(包括带花、果、种子等鉴别特征),每批样品数量至少应为全检验需要量的3倍;与功能主治有关的主要药效学试验资料及文献资料;动物急性毒性试验资料及文献资料;文献古籍对本品性味归经、功能主治等内容的论述;现代研究对传统理论的印证和修订;该中药材应用于方剂的有关研究资料。
(2)若处方中的中药材已制定省级药品标准的,须附上该中药材的名称(中文名、汉语拼音、拉丁名)及命名依据;质量标准及起草说明,对照品及有关资料;稳定性试验资料、结论和有关文献资料等资料及省药品监督管理部门批准件(复印件)。
(3)除中药材外的其他组分,如果未制定药品标准的,须按相应类别报送有关资料并随制剂一起上报审定。